郭亞飛，馬煜明，水劉媛，郭　飛，倪德江

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，武漢 430070)

花青素是一種天然水溶性色素，具有抗氧化、抗衰老、抗消炎、抗突變等多種生理功能?！暇辍铇涫且环N新稍富含花青素的特異種質(zhì)資源，表現(xiàn)為芽、嫩葉和嫩莖均呈紫色?；ㄇ嗨卦谥参矬w內(nèi)的積累受到外界環(huán)境因子(如光、氧、溫度等因素)影響，但主要受自身基因的調(diào)控[1]。調(diào)控植物花青素生物合成的基因主要分為兩類：結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因，結(jié)構(gòu)基因編碼花青素生物合成的催化酶；調(diào)控基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答外界環(huán)境刺激，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的時空表達(dá)。高等植物體內(nèi)的基因表達(dá)是一個復(fù)雜精密的系統(tǒng)，在這個過程中，調(diào)控基因作為開關(guān)和樞紐控制著很多基因的表達(dá)[2]。目前在很多植物中都已研究表明MYB類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控花青素的生物合成。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的一類含有MYB結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。MYB結(jié)構(gòu)域是一段約51～52個氨基酸的肽段，含有高度保守的氨基酸和間隔序列，這些高度保守的氨基酸可以使MYB蛋白的結(jié)構(gòu)域折疊成螺旋-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，將其分為4類：R1/R2-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB。植物中MYB基因編碼的蛋白質(zhì)大多數(shù)是R2R3-MYB蛋白，該類蛋白一般在N端都有2個MYB結(jié)構(gòu)域(R2、R3)，在C端有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，它們廣泛參與調(diào)節(jié)植物初生和次生代謝、應(yīng)答激素刺激、生物和非生物脅迫應(yīng)答等[3]。已有研究表明，擬南芥的第4亞族、第5亞族、第6亞族和第7亞族中的R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子成員參與調(diào)控花青素的生物合成途徑[4-5]。龍膽草中R2R3-MYB型的GtMYBP3和GtMYBP4調(diào)節(jié)龍丹花花冠中黃酮的合成[6]。葡萄中的VvMYBF1促進(jìn)葡萄中類黃酮的合成[7]。Vimolmangkang等[8]發(fā)現(xiàn)蘋果中的MdMYB3參與花青素的生物合成。Mano等[9]發(fā)現(xiàn)番薯中IbMYB1特異調(diào)節(jié)果肉和塊根中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和3GT基因的表達(dá)及花青素的積累。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從‘紫娟’茶樹一芽一葉中成功克隆出了CsMYB123基因的完整開放閱讀框，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并探討了該基因在茶樹不同組織和不同激素處理下的表達(dá)特性，以期為下一步深入研究CsMYB123的生物學(xué)功能奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　材　料

供試材料為‘紫娟’5年生無性系茶樹，種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹種質(zhì)資源圃。于2016年7月，選擇長勢一致、無病蟲害、無環(huán)境污染的劃定區(qū)域，逐次隨機(jī)采摘一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、嫩莖、老莖，分別混勻，裝入已做標(biāo)記的樣品袋，液氮固定，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　方　法

1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成按照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒說明書提取供試樣品總RNA。用DS-11超微量紫外/可見分光光度計(美國丹諾爾公司)檢測所提RNA純度和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。使用TRUEscript RT MasterMix試劑盒合成cDNA，用于RT-PCR和qRT-PCR。

1.2.2茶樹CsMYB123基因的克隆基于本實驗室前期測轉(zhuǎn)錄組篩選得到的CsMYB123基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計克隆引物CsMYB123-QF(5′-ATGGGGAGGAGTCCATGCTGCT-3′)和CsMYB123-QR(5′-TCATGGCCAGTCCTCAGAATCAAGA-3′)。擴(kuò)增體系：2 × Ultra-Pfu Master Mix 酶(Dye Plus) 5 μL、ddH2O 2.4 μL、模板1 μL和正反引物各0.8 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min進(jìn)行32個循環(huán)；72 ℃ 7 min。以第一次的PCR產(chǎn)物為模板1 μL、2 × Ultra-Pfu Master Mix酶(Dye Plus) 12.5 μL、正反引物各0.8 μL、ddH2O 9.9 μL，相同反應(yīng)程序，進(jìn)行第二輪PCR。用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序，最后得到CsMYB123的cDNA序列。

1.2.3生物信息學(xué)分析利用 NCBI 網(wǎng)站對CsMYB123 的 cDNA 序列在線查找 ORF 和同源性分析；利用 EMBL 的SMART 分析CsMYB123 基因編碼氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；多物種氨基酸序列的比對，親水性和疏水性分析用 DNAMAN 6.0軟件；利用在線工具包(SMS) 和 Prot Param 分析氨基酸序列的組成及理化性質(zhì)；運用在線工具 TMHMM server 2.0對 CsMYB123蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析；用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；運用在線工具 SignalP4.1 server 進(jìn)行信號肽的分析和預(yù)測。

1.2.4花青素含量的檢測準(zhǔn)確稱取1.0 g磨碎茶樣，加10 mL沸水，沸水浴中浸提30 min，過濾至容量瓶，加水定容至50 mL作為供試液。吸取2～4 mL供試液放在刻度試管中，加酸性乙醇溶液至10 mL，搖勻立即顯出剛果紅色，顯色30 min后，將澄明的紅色溶液進(jìn)行比色測定。選用535 nm波長，1 cm比色杯，以酸性乙醇為空白對照，測定光密度?；ㄇ嗨睾康挠嬎愎綖椋夯ㄇ嗨?mg/g)=(光密度/吸取溶液量×101.83)/樣品干重。

1.2.5茶樹CsMYB123基因的表達(dá)特性分析將資源圃中的‘紫娟’茶樹，按照5點取樣法設(shè)取樣點，分別用0.1 mmol/L脫落酸(ABA)、1 mmol/L赤霉素(GA3)、1 mmol/L生長素(IAA)、1 mmol/L乙烯利(ETH)、1 mmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)、1 mmol/L水楊酸(SA)處理生長健康、正常、無病蟲害植株的新稍第二葉，處理0(CK)、2、4、8和24 h，處理結(jié)束時立即取樣，混勻，分別裝入已標(biāo)記的樣品袋，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用實時熒光定量PCR，研究CsMYB123基因在‘紫娟’茶樹不同組織和不同激素處理下的表達(dá)模式。CsMYB123基因的檢測引物為CsMYB123-JF(5′-GCTCCAAGGAAGGACTGAAC-3′)和CsMYB123-JR(5′-GCCTGCAACTCTTACCACAT-3′)；內(nèi)參基因GAPDH的引物為GAPDH-JF(5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′)和GAPDH-JR(5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′)。實時熒光定量PCR的操作步驟參照2×Sbyr Green qPCR Mix的說明書進(jìn)行，采用2-ΔΔCT方法[10]進(jìn)行相對定量分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　茶樹 CsMYB123 基因的克隆及序列分析

以‘紫娟’茶樹一芽一葉cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得CsMYB123基因的片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測與目的條帶大小相符(圖1)。對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測序和分析后表明，該基因的開放閱讀框(ORF)長度為915 bp，共編碼304個氨基酸。

2.2　茶樹 CsMYB123 基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1茶樹CsMYB123基因編碼氨基酸序列分析對茶樹CsMYB123基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行SMART分析，結(jié)果表明，在該序列的N端包含2個典型的MYB結(jié)構(gòu)域(R2、R3)(圖2)，R2結(jié)構(gòu)自第17個氨基酸開始(圖3)，每隔19個aa有1個保守的疏水性氨基酸殘基色氨酸W(17、37和57 aa)；R3結(jié)構(gòu)第一個W被異亮氨酸(I，70 aa)所取代，此后每隔18個aa有1個W殘基(89 和108 aa)。該結(jié)構(gòu)域存在于核受體共阻遏物和許多染色質(zhì)重塑復(fù)合物的亞基中，由3個α-螺旋的串聯(lián)重復(fù)序列組成，主要參與DNA結(jié)合。在115～225 aa，存在一個CTD結(jié)合域。該區(qū)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄延伸因子蛋白Spt5與Spt4結(jié)合形成功能性復(fù)合物是必需的，該功能性復(fù)合物可通過RNA聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)早期轉(zhuǎn)錄延伸，并且還可能與mRNA加帽酶相結(jié)合共同參與前體mRNA加工。故CsMYB123基因?qū)儆贛YB家族R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

M．DNA marker；1.退火溫度57 ℃；2.退火溫度59 ℃圖1　茶樹CsMYB123基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M. DNA marker; 1. Annealing temperature 57 ℃; 2. Annealing temperature 59 ℃Fig.1　PCR application of CsMYB123

圖2　CsMYB123 氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2　A putative conserved domain of CsMYB123 amino acid sequence

MYB結(jié)構(gòu)域用陰影標(biāo)出，保守氨基酸用加粗體標(biāo)出圖3　茶樹CsMYB123基因核酸序列與推測的氨基酸序列MYB domains are marked in shadow, and the conserved amino acids are denoted in bold font typeFig.3　The nucleotide and putative amino acid sequences of CsMYB123 gene from tea plant

將CsMYB123基因編碼的氨基酸序列與其他物種R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行序列比對，結(jié)果如圖4所示，它們在MYB結(jié)構(gòu)域所在位置處于高度保守。

2.2.2茶樹CsMYB123基因編碼氨基酸序列的進(jìn)化樹構(gòu)建為了預(yù)測CsMYB123 基因的功能，利用 MAGE7.0軟件對CsMYB123基因編碼的蛋白和擬南芥 MYB 家族基因編碼的蛋白進(jìn)行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示，CsMYB123蛋白與擬南芥中 MYB 家族成員 AtMYB123 聚集在一個單獨的進(jìn)化枝，屬同一亞組，親緣關(guān)系最接近。

2.2.3茶樹CsMYB123基因推導(dǎo)氨基酸組成及理化性質(zhì)用ExPASy的ProtParam在線分析軟件對同源性較高的MYB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果如表1所示，這些植物中的MYB蛋白的氨基酸殘基數(shù)在262～304之間；相對分子量為(2.977～3.407)×104Da；理論等電點在8.05～9.05之間；脂肪族氨基酸的平均含量為31%，芳香族氨基酸的平均含量是6%，酸性氨基酸和堿性氨基酸的平均含量分別是12%和17%。各物種MYB基因編碼氨基酸序列的GRAVY均為負(fù)值，說明CsMYB123為親水性蛋白。親/疏水性分析結(jié)果表明：CsMYB123的第248位(谷氨酸Glu)、第249位(蛋氨酸Met)、第250位(谷氨酸Glu)和第352位(谷氨酸Glu)親水性最強(qiáng)，且親水氨基酸殘基的比例高于疏水氨基酸殘基。推測CsMYB123屬于親水性蛋白，這與該基因編碼氨基酸序列的分析結(jié)果預(yù)測一致。

2.2.4茶樹CsMYB123蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測分析運用在線工具SignalP4.1 server進(jìn)行信號肽的分析和預(yù)測，結(jié)果表明，C值、S值、Y值均小于0.2，推測CsMYB123蛋白無信號肽結(jié)構(gòu)，屬于非分泌蛋白。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析的結(jié)果表明：該蛋白不跨膜。此外，亞細(xì)胞定位預(yù)測分析結(jié)果顯示，CsMYB123主要定位于細(xì)胞核。

圖4　茶樹CsMYB123基因編碼的氨基酸序列與其他植物MYB蛋白序列的保守域比較Fig.4　Comparison of the putative amino acid sequences for CsMYB123 transcription factor in tea plant with other plant MYB proteins

圖5　茶樹 CsMYB123蛋白與擬南芥 MYB 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5　Phylogenetic tree analysis of CsMYB123 protein in tea plant and MYB gene family from A. thaliana

表1　不同物種 R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析

Ⅰ. 一芽一葉；Ⅱ. 二葉；Ⅲ.三葉；Ⅳ.四葉；Ⅴ. 嫩莖；Ⅵ. 老莖；不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同圖6　不同組織中 CsMYB123 基因表達(dá)水平及花青素含量Ⅰ. First leaf and a bud；Ⅱ. Second leaf；Ⅲ.Third leaf；Ⅳ.Fourth leaf；Ⅴ. Tender stem；Ⅵ. Old stem；Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level，the same as belowFig.6　Analysis on expression of CsMYB123 gene and anthocyanin content in different tissues

2.3　不同組織中 CsMYB123 基因表達(dá)水平及花青素含量檢測

檢測不同組織的花青素含量，發(fā)現(xiàn)第二葉中的花青素含量最高(7.36 mg/g)，顯著高于其他組織；其次是一芽一葉，為5.36 mg/g；老莖中的花青素含量最低，為0.49 mg/g(圖6，A)。隨嫩度降低，花青素含量呈先上升后下降的趨勢。

檢測CsMYB123基因在不同組織的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6，B所示，表現(xiàn)為一芽一葉>第二葉>第三葉>第四葉>老莖>嫩莖。CsMYB123基因在一芽一葉中的表達(dá)量是嫩莖的15.68倍。整體上，表達(dá)量隨著嫩度的降低呈下降趨勢。

綜合各組織中的花青素含量與CsMYB123基因表達(dá)水平分析，發(fā)現(xiàn)新稍中的花青素呈高含量累積，且CsMYB123基因在新稍中呈高水平表達(dá)，二者之間存在一定程度的正相關(guān)關(guān)系。

2.4　茶樹CsMYB123基因受不同激素處理后的表達(dá)水平分析

圖7顯示，ABA處理‘紫娟’茶樹新稍第二葉2、4和8 h時，CsMYB123基因表達(dá)量逐漸下降，在24 h時，表達(dá)量恢復(fù)至未處理水平，說明ABA在一定時間內(nèi)下調(diào)茶樹CsMYB123基因的表達(dá)；IAA處理后，CsMYB123基因的表達(dá)量在2 h內(nèi)迅速下降，2 ～ 8 h上升后，在24 h又下降，不同處理時間點的表達(dá)量均低于對照，表明IAA下調(diào)該基因的表達(dá)；GA3處理后，CsMYB123基因的表達(dá)量在2 h內(nèi)迅速下降，4 h上升后在8 h出現(xiàn)下降，在24 h時又升高，但不同處理時間點的表達(dá)水平均低于對照，說明GA3下調(diào)該基因的表達(dá)；ETH處理后，CsMYB123基因的表達(dá)量在2 h內(nèi)迅速下降，4 h上升后在8 h出現(xiàn)下降，在24 h時迅速升高，且只在該時間點的表達(dá)量高于對照，說明ETH在一定時間內(nèi)下調(diào)該基因的表達(dá)；MeJA處理后，CsMYB123基因的表達(dá)量在0～4 h內(nèi)逐漸升高，在4 h時達(dá)到最大，之后又下降，說明MeJA在一定時間內(nèi)上調(diào)該基因的表達(dá)；SA處理后，CsMYB123基因的表達(dá)量在2 h內(nèi)迅速上降，之后逐漸降低，表明SA在短時間內(nèi)下調(diào)該基因的表達(dá)。綜合來看，茶樹CsMYB123基因響應(yīng)多種激素刺激，受激素種類和處理時間不同，其表達(dá)水平也存在差異。

圖7　茶樹CsMYB123 基因在不同激素處理下的表達(dá)分析 Fig.7　Expression analysis of CsMYB123 gene under different hormonal treatments

3　討　論

本實驗從‘紫娟’茶樹中克隆得到CsMYB123基因。序列分析表明，CsMYB123基因編碼的蛋白屬R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子。而R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子已被證明廣泛參與調(diào)控植物中花青素生物合成途徑，VvMYB5a轉(zhuǎn)化煙草可誘導(dǎo)其體內(nèi)酚類化合物花青素和黃酮醇主要組分(花青素鼠李葡萄糖苷和槲皮素-3-鼠李葡萄糖甙)的大量積累[11]；柿樹cvFuyu中DkMYB4被抑制后，原花青素通路相關(guān)基因和原花青素生物合成出現(xiàn)實質(zhì)性的下調(diào)[12]。Stracke等[13]和 Matus等[14]基于同一個亞組中MYB基序相同的現(xiàn)象，將擬南芥的R2R3-MYB分為25個亞組，AtMYB123 (TT2，Q9FJA2)屬于第5亞組(其成員還包括：VvMYB5a、GhMYB38和DkMYB4)。同源性分析結(jié)果表明：CsMYB123蛋白與擬南芥AtMYB123蛋白在同一分支，進(jìn)化關(guān)系最近，推測它們具有類似的生物功能。Ban等[15]研究發(fā)現(xiàn)AtMYB123基因參與調(diào)節(jié)擬南芥種皮中原花青素的生物合成。Nesi等[16]在擬南芥種子發(fā)育階段研究發(fā)現(xiàn)，AtMYB123基因與原花青素生物合成途徑中參與酶基因的表達(dá)模式完全一致。因此，我們推測CsMYB123基因參與茶樹花青素生物合成的調(diào)控。‘紫娟’茶樹不同組織的花青素含量表現(xiàn)為第二葉>一芽一葉>第三葉>第四葉>嫩莖>老莖，這與蔡麗等研究‘紫娟’茶樹新稍第一葉到第四葉的花青苷含量隨葉片嫩度降低而呈顯著下降[17]的結(jié)論相一致。此外，CsMYB123基因在‘紫娟’茶樹新稍中高水平表達(dá)，且其表達(dá)模式與不同組織中的花青素含量呈較好的正相關(guān)，這也從一定程度上說明CsMYB123基因極有可能參與茶樹花青素生物合成的調(diào)控。

激素能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動或阻遏下游基因的表達(dá)，影響植物體內(nèi)次生代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育[18]。在本研究中，IAA、ETH、GA3和ABA 4種激素處理‘紫娟’茶樹新稍第二葉2 h后,CsMYB123基因的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著下降。結(jié)合前人研究，單紅等[19]研究發(fā)現(xiàn)部分R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子可以響應(yīng)激素誘導(dǎo)；Ji等[20]通過高通量測序技術(shù)揭示了與IAA功能相同的人工合成的生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸(NAA)抑制花青素合成途徑中調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；Jeong等[21]發(fā)現(xiàn)ETH可以誘導(dǎo)擬南芥花青素生物合成途徑中相關(guān)的負(fù)調(diào)控基因MYBL2表達(dá)，且抑制相關(guān)正調(diào)控基因(如GL3、TT8和PAP1)的表達(dá)，從而抑制花青素的生物合成；Ilan等[22]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜懸浮細(xì)胞經(jīng)GA3處理后，花青素的累積量顯著下降；Yanhui等[23]通過反向Northern印記研究發(fā)現(xiàn)，AtMYB123基因經(jīng)IAA、ABA、ETH和GA3處理，其表達(dá)水平僅為b-tubulin的5%或更少。綜合來看，推測茶樹CsMYB123基因很有可能參與了激素響應(yīng)刺激，進(jìn)而影響茶樹花青素的生物合成。

總體上，本研究克隆了茶樹CsMYB123基因，并對該基因在不同組織中以及受不同激素處理的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，推測出CsMYB123基因在茶樹花青素代謝的調(diào)控中起重要作用。后續(xù)將通過瞬時表達(dá)、轉(zhuǎn)基因等實驗技術(shù)鑒定CsMYB123基因的功能，并深入研究該基因與花青素生物合成途徑相關(guān)關(guān)鍵酶基因之間的互作關(guān)系，進(jìn)而全面解析其參與茶樹花青素代謝調(diào)控的分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn):

[1]周瓊瓊, 孫威江. 茶樹芽葉紫化的生理生化分析及其關(guān)鍵酶基因的表達(dá)[J]. 生物技術(shù)通報, 2015,31(1): 86-91.

ZHOU Q Q, SUN W J. Physiological and biochemical analysis of young shoot purple-related and gene expression of key enzymes in tea plant (Camelliasinensis) [J].BiotechnologyBulletin, 2015,31(1): 86-91.

[2]房棟, 呂俊宏, 郭旺珍, 等. 一個新的棉花MYB類基因(GhTF1)的克隆及染色體定位分析[J]. 作物學(xué)報, 2008,34(2): 207-211.

FANG D, Lü J H, GUO W Z,etal. Cloning and mapping of a new MYB transcription factor (GhTF1) in cotton [J].ActaAgronomicaSinica, 2008,34(2): 207-211.

[3]萬小榮, 李玲. 植物的MYB蛋白[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2002,38(2): 165-170.

WAN X R, LI L, MYB proteins in plants [J].PlantPhysiologyCommunications, 2002,38(2): 165-170.

[4]STRACKE R, ISHIHARA H, HUEP G,etal. Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription factors controls flavonol accumulation in different parts of theArabidopsisthalianaseedling[J].ThePlantJournal, 2007,50(4): 660-677.

[5]HICHRI I, BARRIEU F, BOGS J,etal. Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway[J].JournalofExperimentalBotany. 2011,62(8):2 465-2 483.

[6]NAKATSUKA T, SAITO M, YAMADA E,etal. Isolation and characterization of GtMYBP3 and GtMYBP4 orthologues of R2R3-MYB transcription factors that regulate early flavonoid biosynthesis in gentian flowers [J].JournalofExperimentalBotany, 2012,63(18): 6 505-6 517.

[7]CZEMMEL S, STRACKE R, WEISSHAAR B,etal. The grapevine R2R3-MYB transcription factor VvMYBF1 regulates flavonol synthesis in developing grape berries [J].PlantPhysiology, 2009,151(3): 1 513-1 530.

[8]VIMOLMANGKANG S, HAN Y, WEI G,etal. An apple MYB transcription factor MdMYB3 is involved in regulation of anthocyanin biosynthesis and flower development [J].BMCPlantBiology, 2013,13(1): 176-189.

[9]MANO H, OGASAWARA F, SATO K,etal. Isolation of a regulatory gene of anthocyanin biosynthesis in tuberous roots of purple-fleshed sweet potato[J].PlantPhysiology, 2007,143(3): 1 252-1 268.

[10]SCHAFFER A, ARAVIND L, MADDEN T,etal. Improving the accuracy of PSI-BLAST protein database searches with composition-based statistics and other refinements [J].NucleicAcidsResearch, 2001,14(29): 2 994-3 005.

[11]BARRIEU F, LAUVERGEAT V, CARDE J P. Characterization of a grapevine R2R3-MYB transcription factor that regulates the phenylpropanoid pathway [J].PlantPhysiology, 2006,140(2): 499-511.

[12]AKAGI T, IKEGAMI A, TSUJIMOTO T,etal. DkMYB4 is a MYB transcription factor involved in proanthocyanidin biosynthesis in persimmon fruit[J].PlantPhysiology, 2009,151(4): 2 028-2 045.

[13]STRACKE R, WERBER M, WEISSHAAR B. The R2R3-MYB gene family inArabidopsisthaliana[J].CurrentOpinioninPlantBiology. 2001,4(5): 447-456.

[14]MATUS J T, AQUEA F, ARCE-JOHNSON P. Analysis of the grape MYB R2R3, subfamily reveals expanded wine quality-related clades and conserved gene structure organization acrossVitis, andArabidopsis, genomes[J].BMCPlantBiology, 2008,8(1): 83-98.

[15]BAN T, ISHIMARU M., KOBAYASHI S,etal. Abscisic acid and 2,4-dichlorohenoxyacetic acid affect the expression of anthocyanin biosynthetic pathway genes in‘Kyoho’grape berries[J].JournalofHorticulturalScience&Biotechnology, 2003,78(4): 586-589.

[16]NESI N, JOND C, DEBEAUJON I,etal. TheArabidopsisTT2 gene encodes an R2R3 MYB domain protein that acts as a key determinant for proanthocyanidin accumulation in developing seed [J].ThePlantCell, 2001,13(9): 2 099-2 114.

[17]蔡麗, 梁名志, 夏麗飛,等. “紫娟”茶外觀表象差異研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2010,23(3): 700-703.

CAI L, LIANG M Z, XIA L F,etal. Study on exterior appearance difference of ‘Zijuan’[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences. 2010,23(3): 700-703.

[18]岳川, 曾建明, 章志芳,等. 茶樹中植物激素研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué), 2012,32(5):382-392.

YUE C, ZENG J M, ZHANG Z F,etal. Research process in the phytohormone of tea plant (Camelliasinensis)[J].JournalofTeaScience, 2012,32(5): 382-392.

[19]SHAN H, CHEN S, JIANG J,etal. Heterologous expression of the chrysanthemum R2R3-MYB transcription factor CmMYB2 enhances drought and salinity tolerance, increases hypersensitivity to ABA and delays flowering inArabidopsisthaliana[J].MolecularBiotechnology, 2012,51(2): 160-173.

[20]JI X H, ZHANG R, WANG N,etal. Transcriptome profiling reveals auxin suppressed anthocyanin biosynthesis in red-fleshed apple callus (Malussieversiif.niedzwetzkyana)[J].PlantCellTissue&OrganCulture, 2015,123(2): 389-404.

[21]JEONG S W, DAS P K, JEOUNG S C,etal. Ethylene suppression of sugar-induced anthocyanin pigmentation inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2010,154(3): 1 514-1 531.

[22]ILAN A, DOUGALL D K. The effect of growth retardants on anthocyanin production in carrot cell suspension cultures [J].PlantCellReports, 1992,11(5-6): 304-309.

[23]CHEN H Y, YANG X Y, HE K,etal. The MYB transcription factor superfamily ofArabidopsis: expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family [J].PlantMolecularBiology, 2006,60(1): 107-124.