張克闖，楊紅蘭，李小雙，張道遠(yuǎn)*，王玉成

(1 中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所 干旱區(qū)生物地理與生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

白番紅花(CrocusalatavicusRegel et Sem.)屬鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬(CrocusL.)藥用植物，產(chǎn)于中國(guó)新疆伊犁河谷，中亞也有分布，生于海拔1 200～3 000 m的寒冷山坡及河灘草地[1]。常形成層片或小群落。本種花白色，可作園林早春花卉，新疆民間用球莖作藥用[1-2]。屬多年生早春類短命植物，能在積雪覆蓋下完成開(kāi)花結(jié)實(shí)，具有極強(qiáng)的抗寒性[2]。

CBFs/DREB1蛋白(C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding factors 1)屬于AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子[3]。在逆境條件下CBFs/DREB1蛋白能有效地與CRT/DRE(C-repeat /dehydration responsive element)脫水響應(yīng)元件結(jié)合，并激活其下游COR(cold-regulated)基因的轉(zhuǎn)錄，提高植物抵抗低溫、干旱以及高鹽等非生物脅迫的能力[4]。1997年首次從擬南芥中克隆得到CBF1/DREB1B轉(zhuǎn)錄因子，并證明其參與擬南芥的抗冷信號(hào)通路[5]。CBF1轉(zhuǎn)錄因子雖然是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，但研究表明，CBF冷反應(yīng)信號(hào)通路的各個(gè)組成因子在開(kāi)花植物中高度保守。近些年來(lái)在不同的物種中均證明CBF1基因參與植物的冷調(diào)控，如水稻[6]、胡楊[7]、葡萄[8]、桑樹(shù)[9]、蘋(píng)果[10]、大豆[11]、棉花[12]、玉米[13]、短柄草[14]等植物中均證明CBF1基因參與抗冷調(diào)控。但上述研究多見(jiàn)于重要的經(jīng)濟(jì)作物及經(jīng)濟(jì)果木中，有關(guān)野生的、抗寒性強(qiáng)的(類)短命植物中CBF1基因卻鮮見(jiàn)詳細(xì)研究。本研究首次克隆得到多年生早春短命類植物白番紅花CrCBF1基因序列，在對(duì)CrCBF1的基因特性進(jìn)行研究的同時(shí)，通過(guò)酵母功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1中過(guò)表達(dá)CrCBF1基因可以提高重組酵母的抗寒性，初步驗(yàn)證CrCBF1基因參與冷調(diào)控信號(hào)通路。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為野生白番紅花，采自新疆新源縣(82°15′ E，43°29′ N)，材料連同根系土壤一并帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈、去土液氮冷凍，放入-80℃超低溫冰箱保存。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1菌株、酵母Y2H菌株、酵母自激活陽(yáng)性對(duì)照菌株、農(nóng)桿菌EHA105菌株、酵母表達(dá)載體pYES2及pGBKT7、亞細(xì)胞定位載體pBI121-GFP均由本實(shí)驗(yàn)室保存；植物組織總RNA提取試劑盒Plant RNA Kit、質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit及瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒Gel Extraction Kit均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、DNA Marker 2000、限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、載體連接試劑盒pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit均購(gòu)自北京全式金公司；引物合成及序列測(cè)定由北京華大基因有限公司完成。

1.2　總RNA的提取和cDNA的合成

取0.1 g白番紅花葉片材料(-80 ℃超低溫冰箱保存)，利用Plant RNA Kit試劑盒提取總RNA，提取的RNA用NanoDrop 2000檢測(cè)，利用1%凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。選擇A260/A280值在1.9到2.1之間，質(zhì)量濃度大于200 ng·μL-1且條帶清晰的RNA用于反轉(zhuǎn)。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行總RNA的cDNA反轉(zhuǎn)錄,合成第一鏈cDNA。

1.3　白番紅花CrCBF1基因的克隆

根據(jù)NCBI已發(fā)表的鳶尾科植物馬藺[IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.]的IlCBF1基因序列(GenBank登錄號(hào)DQ131497)設(shè)計(jì)特異性引物CrCBF1-F/R(表1)。以cDNA為模板，使用TaKaRa Ex Taq RR001聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)并回收，產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落搖菌，菌液PCR鑒定陽(yáng)性菌株測(cè)序。

1.4　白番紅花CrCBF1基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)CrCBF1基因的cDNA序列，利用NCBI的ORF finder工具尋找開(kāi)放閱讀框，再將ORF序列翻譯成氨基酸序列。利用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam工具計(jì)算CrCBF1蛋白的理論分子量、等電點(diǎn)等基本參數(shù)。利用NCBI CDD工具分析序列的結(jié)構(gòu)域及功能元件。利用MEGA5.0軟件通過(guò)鄰近法構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用Phyre2分析CrCBF1蛋白的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5　白番紅花CrCBF1蛋白亞細(xì)胞定位分析

構(gòu)建pBI121-CrCBF1-GFP融合植物表達(dá)載體，利用SmaI限制性內(nèi)切酶把環(huán)狀pBI121-GFP載體切成線狀。設(shè)計(jì)引物CrpBI121-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收，利用pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit試劑盒，把目的基因片段連入pBI121-GFP線性載體，構(gòu)建pBI121-CrCBF1-GFP重組載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株送北京華大基因公司測(cè)序，序列比對(duì)正確的菌株搖菌，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。利用農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，把含有融合表達(dá)載體的農(nóng)桿菌注射到2周大的本氏煙草葉片的組織細(xì)胞間隙，共培養(yǎng)3～5 d，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片表皮，同時(shí)以不含目的基因的pBI121-GFP空載體為對(duì)照。

1.6　白番紅花CrCBF1轉(zhuǎn)錄因子激活活性分析

構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGBKT7-CrCBF1，用BamH I 和EcoR I 限制性內(nèi)切酶對(duì)pGBKT7 載體進(jìn)行雙酶切，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。設(shè)計(jì)引物CrpGBKT7-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化回收。利用pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit試劑盒，把目的基因片段連入pGBKT7 線性載體，構(gòu)建pGBKT7-CrCBF1重組載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株送北京華大基因公司測(cè)序。序列比對(duì)正確的菌株搖菌，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母Y2H，酵母的轉(zhuǎn)化采用PEG/LiAc法[15]，轉(zhuǎn)化后的酵母經(jīng)SD/-Trp固體篩選培養(yǎng)基30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落接種于SD/-Trp單缺液體培養(yǎng)基，30 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600為2.0。菌液分別點(diǎn)于SD/-Trp/-His及SD/-Trp/-His/X-α-Gal 固體篩選培養(yǎng)基上。30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落的生長(zhǎng)及顯色情況，并以轉(zhuǎn)入空載pGBKT7的酵母作為陰性對(duì)照，同時(shí)以含有pGBKT7-EsDREB2B載體的酵母菌株作為陽(yáng)性對(duì)照[16]。

1.7　白番紅花CrCBF1基因酵母功能驗(yàn)證分析

構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-CrCBF1，利用Kpn1單酶切質(zhì)粒pYES2，設(shè)計(jì)特異性引物CrpYES2-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化回收，利用pEASY?Uni Seamless Cloning and Assembly Kit試劑盒，目的基因片段連入pYES2線性載體，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-CrCBF1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株送北京華大基因公司測(cè)序，序列比對(duì)正確的菌株搖菌，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1，酵母的轉(zhuǎn)化采用PEG/LiAc法[15]。酵母涂布于SC-U尿嘧啶缺陷型固體篩選培養(yǎng)基(終濃度2%葡萄糖為碳源)中30 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取單克隆酵母菌落于SC-U(終濃度2%葡萄糖為碳源)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.8，之后菌體重懸于SC-U(終濃度2%半乳糖為碳源)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，調(diào)整OD600為0.4，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h。收集菌體重懸于SC-U(終濃度2%葡萄糖為碳源)液體培養(yǎng)基中，調(diào)整OD600為2.0。-20 ℃冷脅迫72 h[17-18]。脅迫后的菌液在SC-U(終濃度2%葡萄糖為碳源)固體培養(yǎng)基上進(jìn)行梯度稀釋驗(yàn)證，觀察菌株的存活狀況，并以轉(zhuǎn)入空載pYES2的酵母作為對(duì)照。

2　結(jié)果與分析

2.1　白番紅花CrCBF1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以白番紅花cDNA為模板，以設(shè)計(jì)的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，把純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體后送樣測(cè)序，得到CrCBF1完整的cDNA序列。結(jié)果顯示白番紅花CrCBF1基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為642 bp,共編碼213個(gè)氨基酸。

ProtParam工具計(jì)算顯示，CrCBF1蛋白的分子量為23.8 kD，理論等電點(diǎn)為4.99。利用NCBI中BLASTP同源性檢索，發(fā)現(xiàn)該序列和馬藺(Irislacteavar.lactea)IlCBF1(AAZ57434.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCBF1(NM118681)、蘿卜(Raphanussativus)RsCBF1(ACX48435.1)的相似性分別達(dá)到97%、98%和77%。利用ExPASy的SOPMA工具對(duì)CrCBF1氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，顯示CrCBF1蛋白由32.39%的α-螺旋(alpha helix)，7.98%的β-折疊(beta turn)，15.02%的延伸主鏈(extended strand)和44.60%的無(wú)規(guī)卷曲(random coil)組成，可以看出，無(wú)規(guī)卷曲是CrCBF1蛋白的主要組成部分，α-螺旋、β-折疊以及延伸主鏈則散布在蛋白序列中。利用NCBI蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析工具CDD分析顯示，CrCBF1蛋白在第46～106個(gè)氨基酸之間是AP2/ERF保守序列(圖1)。利用Phyre 2.0工具分析CrCBF1蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域，顯示這個(gè)結(jié)構(gòu)域由3條反向的β折疊、1條α螺旋和一段無(wú)規(guī)卷曲組成，其對(duì)應(yīng)的序列在圖1中標(biāo)出。利用MEGA5.0軟件，通過(guò)鄰近法構(gòu)建CrCBF1蛋白與其他物種的同源關(guān)系進(jìn)化樹(shù)(圖2)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示：白番紅花CrCBF1蛋白除了與單子葉植物馬藺蛋白進(jìn)化樹(shù)關(guān)系相近，與其他單子葉植物大麥、水稻及羅漢竹的CBF1蛋白進(jìn)化樹(shù)關(guān)系較遠(yuǎn)，而與雙子葉植物親緣關(guān)系較近，發(fā)現(xiàn)與十字花科物種的擬南芥、小白菜和蘿卜CBF1蛋白進(jìn)化樹(shù)關(guān)系相近。

DQ074478.蘋(píng)果；ABV27087.擬南芥；AAL84170.大麥；.β-折疊；.α-螺旋圖1　白番紅花CrCBF1與其他植物CBF1蛋白的多重序列比對(duì)DQ074478.Malus domestica；ABV27087.Arabidopsis thaliana；AAL84170.Hordeum vulgare；.β-sheet；.α-helixFig.1　Multiple alignment of CBF1 proteins in Crocus alatavicus and other plants

2.2　白番紅花CrCBF1蛋白亞細(xì)胞定位分析

含有融合表達(dá)載體pBI121-CrCBF1-GFP的農(nóng)桿菌注射到2周大的本氏煙草幼苗中，使得農(nóng)桿菌進(jìn)入到煙草的組織細(xì)胞間隙，利用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片表皮，顯示目的蛋白攜帶的GFP發(fā)出的綠色熒光定位在細(xì)胞核(圖3)，在空載的對(duì)照中，GFP發(fā)射的熒光定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜(圖3)。結(jié)果表明白番紅花CrCBF1蛋白定位于細(xì)胞核，此結(jié)果和擬南芥AtCBF1蛋白定位結(jié)果一致[5]。

2.3　白番紅花CrCBF1轉(zhuǎn)錄因子激活活性分析

觀察在涂有X-α-Gal的篩選培養(yǎng)基上陽(yáng)性菌株的生長(zhǎng)及顯色情況來(lái)檢測(cè)基因的自激活活性,結(jié)果如圖4所示,結(jié)果表明：陰性對(duì)照，即轉(zhuǎn)pGBKT7空載Y2H酵母，在單缺培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)，在雙缺培養(yǎng)基及涂有X-α-Gal的雙缺培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)不顯色，陽(yáng)性對(duì)照(實(shí)驗(yàn)室保存)和重組酵母均可以在雙缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并在涂有X-α-Gal雙缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)顯藍(lán)色，表明CrCBF1蛋白具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

圖4　CrCBF1自激活活性分析Fig.4　Transactivation activity assay of CrCBF1 in yeast cells

A～C. CrCBF1在煙草中的定位情況；D～F. 空載pBI121-GFP在煙草中的定位情況。A、D. 熒光通道；B、E. 明場(chǎng)；C、F. 疊加圖；圖3　白番紅花CrCBF1蛋白在煙草中的亞細(xì)胞定位A-C.Nicotiana tabacum L. cells were transformed with CrCBF1； D-F.N. tabacum L. cells were transformed with pBI121-GFP. A， D. Fluorescence；B， E. Bright field；C， F. MergeFig.3　Subcellular localization of CrCBF1 protein in N. tabacum L.

10-1、10-2、10-3、10-4、10-5分別代表菌液稀釋10、100、1 000、10 000、100 000倍A. 無(wú)脅迫(對(duì)照)；B. -20 ℃冷脅迫72 h圖5　重組酵母和對(duì)照酵母在冷脅迫條件下的生長(zhǎng)狀況10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 represent 10, 100, 1 000, 10 000, 100 000 times dilutions of yeast cellsA. Non-stress (control)；B. Freezing stress (-20 ℃) for 72 hoursFig.5　Growth of S. cerevisiae yeast cells transformed with the empty vector pYES2 and with the pYES2-CrCBF1 under cold stress conditions

2.4　白番紅花CrCBF1基因酵母功能驗(yàn)證分析

為研究CrCBF1基因的功能，挑取重組酵母和對(duì)照酵母單克隆菌落，在以葡萄糖為碳源的SC-U篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.8，然后在以β-半乳糖為碳源的SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(調(diào)整OD600為0.4)誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h，進(jìn)行冷脅迫處理。由圖5可見(jiàn)，在非脅迫條件下重組酵母和對(duì)照酵母的生長(zhǎng)狀況基本一致(轉(zhuǎn)基因酵母相對(duì)于對(duì)照酵母長(zhǎng)勢(shì)稍差一些)，而在20 ℃黑暗冷處理72 h后，重組酵母的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于對(duì)照酵母的生長(zhǎng)狀況，表明在酵母中過(guò)表達(dá)CrCBF1基因可以提高酵母的抗寒能力。

3　討　論

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的大家族轉(zhuǎn)錄因子，包括4個(gè)主要的亞家族：AP2、RAV、ERF和DREB亞家族[19]，CBFs蛋白又稱為DREB1蛋白[20]，屬AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子，能識(shí)別CRT/DRE冷及脫水響應(yīng)元件，在擬南芥中很多冷及脫水響應(yīng)相關(guān)基因的啟動(dòng)子中均含CRT/DRE元件[21]，CRT/DRE元件含有保守的5 bp核心基序CCGAC[22]。

本實(shí)驗(yàn)克隆得到了白番紅花CrCBF1基因的cDNA序列，序列分析表明，CrCBF1蛋白有一個(gè)由60個(gè)氨基酸組成的AP2結(jié)構(gòu)域，且在AP2結(jié)構(gòu)域的上下游分別含有被認(rèn)為是CBF轉(zhuǎn)錄因子特征序列的兩段短肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR[23]，分別位于AP2基序的上游和下游，推測(cè)可能為CBF蛋白的核定位信號(hào)區(qū)及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)[5, 24]，這2段保守序列也表明CrCBF1是典型的CBF轉(zhuǎn)錄因子。

亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)顯示，CrCBF1轉(zhuǎn)錄因子主要作用于細(xì)胞核，這一結(jié)論與擬南芥AtCBF1轉(zhuǎn)錄因子[5]、短柄草BdCBF1轉(zhuǎn)錄因子[14]定位結(jié)果一致，但也有些轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜，如OsDREB2E轉(zhuǎn)錄因子[25]，有研究表明一些轉(zhuǎn)錄因子可分布在細(xì)胞質(zhì)中作為結(jié)構(gòu)蛋白參與細(xì)胞質(zhì)的重要反應(yīng)[26]。轉(zhuǎn)錄因子主要在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，所以一般定位于細(xì)胞核，一些轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)或者多個(gè)NLS區(qū)，可引導(dǎo)其進(jìn)入細(xì)胞核，也有些轉(zhuǎn)錄因子不含NLS，通過(guò)和其它轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物以進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄因子也可以在分子伴侶及其它跨膜蛋白的作用下通過(guò)對(duì)自身構(gòu)象的改變以作用于不同的細(xì)胞器。

在酵母功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，對(duì)轉(zhuǎn)CrCBF1基因酵母和轉(zhuǎn)空載酵母進(jìn)行干、鹽、冷和熱脅迫，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因酵母在冷脅迫下，其耐冷性強(qiáng)于轉(zhuǎn)空載酵母，而在干(30% PEG6000 48 h)、鹽(5 mol·L-1NaCl 48 h)及熱(45 ℃ 48 h)的脅迫下，其生長(zhǎng)狀況和轉(zhuǎn)空載酵母相比并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)表)，表明CrCBF1基因在酵母中主要參與調(diào)控冷相關(guān)基因的表達(dá)，不響應(yīng)干、鹽及熱等脅迫，這一結(jié)論與在擬南芥中AtCBF1基因的表達(dá)只受低溫脅迫調(diào)控，而不受干、鹽脅迫調(diào)控結(jié)果一致[27]。本實(shí)驗(yàn)采用的酵母為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1菌株，冷脅迫處理方法為-20 ℃處理72 h，Rodriguezvargas報(bào)道，在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)ERG10基因，在-20 ℃處理5 d后，釀酒酵母出現(xiàn)生存率表型差異[18]，李海燕等報(bào)道，在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)齒肋赤蘚ScDREB基因，-20 ℃處理36 h后，釀酒酵母出現(xiàn)表型差異[28]，這些實(shí)驗(yàn)不同的冷處理時(shí)間可能和脅迫前菌液的濃度以及脅迫后點(diǎn)樣的量相關(guān)，也可能是由于過(guò)表達(dá)不同的基因?qū)湍傅淖饔脵C(jī)制不同導(dǎo)致表型差異所需的時(shí)間不同。

本實(shí)驗(yàn)克隆得到了白番紅花CrCBF1基因，初步探討了該基因的一些特性，酵母功能驗(yàn)證表明CrCBF1基因可以提高酵母的耐冷性能，為下一步擬南芥體系功能驗(yàn)證及基因開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]高紅艷,楊元華,劉靜,等. 白番紅花球莖醇提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用研究[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2016, (3): 8-9.

GAO H Y, YANG Y H, LIU J,etal. Study on analgesic and anti-inflammation effects of the compounds isolated from corm ofCrocusalatavicuswith ethanol[J].ChineseJournalofEthnomedicine&Ethnopharmacy, 2016,(3): 8-9.

[2]毛祖美,張佃民. 新疆北部早春短命植物區(qū)系綱要[J]. 干旱區(qū)研究, 1994, (3): 1-26.

MAO Z M, ZHANG D M. The conspectus of ephemeral flora in Northern Xinjiang[J].AridZoneResearch, 1994,(3): 1-26.

[3]RIECHMANN J L,MEYEROWITZ E M. The AP2/EREBP family of plant transcription factors[J].BiologicalChemistry, 1998,379(6): 633-646.

[4]THOMASHOW M F. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance[J].PlantPhysiology, 1998,118(1): 1.

[5]STOCKINGER E J,GILMOUR S J,THOMASHOW M F.ArabidopsisthalianaCBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 1997,94(3): 1 035-1 040.

[6]DUBOUZET J GSAKUMA YITO Y,etal.OsDREBgenes in rice,OryzasativaL., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression[J].PlantJournal, 2003,33(4): 751-763.

[7]BENEDICT CSKINNER J SMENG R,etal. The CBF1-dependent low temperature signalling pathway, regulon and increase in freeze tolerance are conserved inPopulusspp.[J].PlantCellandEnvironment, 2006,29(7): 1 259-1 272.

[8]SIDDIQUA M,NASSUTH A. Vitis CBF1 and Vitis CBF4 differ in their effect onArabidopsisabiotic stress tolerance, development and gene expression[J].PlantCellandEnvironment, 2011,34(8): 1 345-1 359.

[9]張林,劉曉格,方榮俊,等. 桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的克隆及序列特征與低溫應(yīng)激表達(dá)[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2013,39(6): 1 029-1 035.

ZHANG L, LIU X G, FANG R J,etal. Molecular cloning, sequence characteristics and low temperature responsive expression of mulberry transcription factorCBF1 gene[J].ScienceofSericulture, 2013,39(6):1 029-1 035.

[10]鄭建立. 富士蘋(píng)果MdCBF1基因的功能分析[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[11]PENNYCOOKE J CCHENG H MROBERTS S M,etal. The low temperature-responsive, SolanumCBF1 genes maintain high identity in their upstream regions in a genomic environment undergoing gene duplications, deletions, and rearrangements[J].PlantMolecularBiology, 2008,67(5): 483-497.

[12]MA L F， ZHANG J M, HUANG G Q,etal. Molecular characterization of cotton C-repeat/dehydration-responsive element binding factor genes that are involved in response to cold stress[J].MolecularBiologyReports, 2014,41(7): 4 369-4 379.

[13]NGUYEN H, TLEIPNER J, STAMP P,etal. Low temperature stress in maize (ZeamaysL.) induces genes involved in photosynthesis and signal transduction as studied by suppression subtractive hybridization[J].PlantPhysiology&Biochemistry, 2009,47(2): 116-122.

[14]RYU J, YHONG S Y, JO S H,etal. Molecular and functional characterization of cold-responsive C-repeat binding factors fromBrachypodiumdistachyon[J].BmcPlantBiology, 2014,14(1):15.

[15]王留強(qiáng), 檉柳真核起始因子5A(e1F5A)基因的功能[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué),2012.

[16]LI X, ZHANG D, LI H,etal. EsDREB2B , a novel truncated DREB2-type transcription factor in the desert legumeEremospartonsongoricum, enhances tolerance to multiple abiotic stresses in yeast and transgenic tobacco[J].BmcPlantBiology, 2014,14(1): 44.

[17]WANG B F, WANG Y C, ZHANG D W,etal. Verification of the resistance of a LEA gene fromTamarixexpression inSaccharomycescerevisiaeto abiotic stresses[J].JournalofForestryResearch, 2008,19(1): 58-62.

[18]RODRIGUEZVARGAS S,ESTRUCH F,RANDEZGIL F. Gene expression analysis of cold and freeze stress in Baker’s yeast[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology, 2002,68(6): 3 024-3 030.

[19]SAKUMA Y, LIU Q, DUBOUZET J G,etal. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain ofArabidopsisDREBs, transcription factors involved in dehydration and cold-inducible gene expression[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications, 2002,290(3): 998-1 009.

[20]LIU Q, KASUGA M, SAKUMA Y,etal. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, inArabidopsis[J].PlantCell, 1998,10(8): 1 391-1 406.

[21]THOMASHOW M F. PLANT COLD ACCLIMATION: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms[J].AnnualReviewofPlantBiology, 2003,50(50): 571-599.

[22]THOMASHOW M F. So what’s new in the field of plant cold acclimation? Lots![J].PlantPhysiology, 2001,125(1): 89.

[23]JAGLO K R,THOMASHOW M F. Components of theArabidopsisC-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold-response pathway are conserved inBrassicanapusand other plant species[J].PlantPhysiology, 2001,127(3): 910-917.

[24]AKHTAR M, JAISWAL A, TAJ G,etal. DREB1/CBF transcription factors: their structure, function and role in abiotic stress tolerance in plants[J].JournalofGenetics, 2012,91(3): 385-395.

[25]MATSUKUR A S, MIZOI J, YOSHIDA T,etal. Comprehensive analysis of rice DREB2-type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes[J].MolecularGenetics&Genomics, 2010,283(2): 185-196.

[26]宿明星, 遼寧堿蓬S/NAC4、S/NAC10轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及功能分析[D]. 沈陽(yáng)： 遼寧師范大學(xué),2015.

[27]GILMOUR S, JZARKA D, GSTOCKINGER E J,etal. Low temperature regulation of theArabidopsisCBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression[J].PlantJournal, 1998,16(4): 433.

[28]LI H Y, ZHANG D Y, LI X S,etal. Novel DREB A-5 subgroup transcription factors from desert moss (Syntrichiacaninervis) confers multiple abiotic stress tolerance to yeast[J].JournalofPlantPhysiology, 2016,194:45-53.