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(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，　新疆 石河子 832003)

青稞亦稱裸大麥，是生長(zhǎng)在我國(guó)西北、西南的一種重要的谷類作物。淀粉是青稞籽粒的主要成分之一，占籽粒干重的65%左右。淀粉又可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，兩者的比例是決定淀粉理化特性的重要指標(biāo)，而淀粉的理化特性與青稞食品的質(zhì)地和表觀性狀密切相關(guān)[1]。

青稞通過(guò)光合作用生成光合產(chǎn)物，光合產(chǎn)物從源器官通過(guò)一系列的維管系統(tǒng)以蔗糖的形式運(yùn)輸?shù)綆?kù)器官，之后再經(jīng)過(guò)相關(guān)酶催化生成淀粉。淀粉代謝相關(guān)酶主要有腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase，AGPP)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase，SSS)、束縛態(tài)淀粉合成酶(granule bound starch synthase，GBSS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)[2-4](合成方向)、α-淀粉酶[5](EC 3.2.1.1)和β-淀粉酶[6](EC 3.2.1.2)(降解方向)。有關(guān)淀粉積累和淀粉代謝酶的關(guān)系已經(jīng)進(jìn)行了許多研究[4,7]，但關(guān)于青稞灌漿期內(nèi)籽粒的淀粉積累特征、淀粉代謝酶活性的動(dòng)態(tài)變化及二者的關(guān)系報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)以3個(gè)不同品種青稞為材料，對(duì)籽粒灌漿過(guò)程中淀粉積累的特征和淀粉代謝酶活性進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在探索青稞籽粒灌漿期淀粉積累特征和代謝酶學(xué)機(jī)制，為新品種的選育及品質(zhì)鑒定提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與設(shè)計(jì)

選取青稞品種北青6號(hào)(淀粉含量為97.95%±1.34%[8])、昆侖12號(hào)(總淀粉含量為95.57%±0.56%[8])和甘墾5號(hào)(支鏈淀粉含量高達(dá)98.94%[9])為研究對(duì)象。2015年4—7月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站種植，人工條播，行距20 cm，株距2 cm，小區(qū)面積5 m2，3次重復(fù)。青稞開(kāi)花期，掛牌、標(biāo)記穗子中上部穎花在同一天開(kāi)花的穗子，于花后5，10，15，20，25，30，35 d取樣。每個(gè)小區(qū)取40穗，分為兩部分，一部分用于淀粉含量的測(cè)定，處理方法：先將籽粒在105 ℃恒溫下殺青30 min，然后將溫度調(diào)至70 ℃恒溫烘干至恒質(zhì)量；另一部分用于酶活性測(cè)定，處理方法：將剝?nèi)〉淖蚜Ｓ缅a箔紙包裹，侵入液氮中冷激，取出放入-80 ℃低溫下備用。

1.2　測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1酶活性與淀粉含量的測(cè)定

參照程方民等[10]的方法進(jìn)行青稞籽粒粗酶液提??；用Nakamura等[11]的方法測(cè)定AGPP、SSS和GBSS的活性變化；用李太貴等[12]的方法測(cè)定SBE的活性變化；參照何照范等[13]的雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定淀粉含量；α-淀粉酶與β-淀粉酶活性的測(cè)定參照DNS還原糖法。

1.2.2淀粉積累特征參數(shù)的計(jì)算

根據(jù)淀粉積累量(y)與開(kāi)花后天數(shù)(t)建立Logistic方程y=k/(1+eA+Bt)，式中，A、B為參數(shù)，K為生長(zhǎng)終值量。采用Curve Expert 1.4對(duì)籽粒支鏈淀粉和直鏈淀粉積累過(guò)程進(jìn)行擬合[14]，通過(guò)對(duì)方程求一階導(dǎo)數(shù)可以得到淀粉積累速率方程，并可得出淀粉積累特征參數(shù)。積累速率最大時(shí)的日期Tmax=-A/B；積累活躍生長(zhǎng)期(大約完成淀粉總積累量的90%)D=[ln(1/9)-A]/B；平均積累速率Vmean=K/D；最大積累速率Vmax=-KB/4；積累起始勢(shì)C0=K/(1+eA)[14]。

2　結(jié)果與分析

2.1　青稞籽粒灌漿期淀粉合成酶活性

從圖1 a可看出，3個(gè)青稞品種的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性均呈單峰曲線變化。北青6號(hào)的最大腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性峰值和達(dá)到最大酶活性峰值的時(shí)間與昆侖12號(hào)和甘墾5號(hào)存在差異，北青6號(hào)在花后25 d達(dá)到峰值外，昆侖12號(hào)和甘墾5號(hào)均在花后20 d達(dá)到峰值；酶活性峰值表現(xiàn)為北青6號(hào)>昆侖12號(hào)>甘墾5號(hào)。

從圖1 b可看出，非糯性青稞品種北青6號(hào)和昆侖12號(hào)分別在花后20 d和花后25 d左右達(dá)到酶活性峰值；顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)灌漿前期的酶活性變化在昆侖12號(hào)和北青6號(hào)中差異并不顯著，而在灌漿后期兩者之間的GBSS酶活性差異變大，昆侖12號(hào)的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶活性明顯大于北青6號(hào)，昆侖12號(hào)的直鏈淀粉最終積累量也較北青6號(hào)高。另外，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)活性在糯性青稞品種甘墾5號(hào)中未檢測(cè)到。由此推斷，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)活性與青稞籽粒直鏈淀粉合成有關(guān)，決定直鏈淀粉積累量。

從圖1 c可看出，昆侖12號(hào)、北青6號(hào)和甘墾5號(hào)的SSS活性均在花后20 d左右達(dá)到峰值，然而在不同類型的青稞品種中，SSS的活性變化之間存在明顯的差異。青稞品種北青6號(hào)在整個(gè)灌漿期SSS活性變化比較平緩，酶活性峰值也較小。SSS主要參與支鏈淀粉的合成，不同支鏈淀粉含量的青稞品種可溶性淀粉合成酶酶活性峰值表現(xiàn)為甘墾5號(hào)>昆侖12號(hào)>北青6號(hào)。這是因?yàn)楦蕢?號(hào)的淀粉主要組成成分為支鏈淀粉，其百分含量可達(dá)98.94%，從而在整個(gè)灌漿過(guò)程中，甘墾5號(hào)的可溶性淀粉合成酶活性均大于另外2個(gè)青稞品種。

由圖1 d可看出，3個(gè)青稞品種淀粉分支酶活性均呈單峰曲線，且各品種均在花后20 d左右達(dá)到峰值。各品種青稞淀粉分支酶活性大小為甘墾5號(hào)>北青6號(hào)>昆侖12號(hào)，支鏈淀粉含量較高的青稞品種淀粉分支酶活性峰值也較大。

2.2　籽粒灌漿期淀粉降解酶活性

圖1　3個(gè)青稞品種籽粒灌漿期淀粉合成酶的活性變化

圖2　3個(gè)青稞品種籽粒灌漿期淀粉分解酶的活性變化

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了3個(gè)青稞品種灌漿期淀粉降解酶(α-淀粉酶)的活性變化，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)青稞品種的α-淀粉酶活性呈現(xiàn)降—升—降的趨勢(shì)，且3個(gè)品種之間無(wú)顯著差異。花后10 d左右最高，北青6號(hào)在花后15 d酶活性達(dá)到峰谷，而甘墾5號(hào)和昆侖12號(hào)在花后20 d達(dá)到峰谷，這可能是由于品種之間的差異造成的；3個(gè)品種的α淀粉酶活性均在花后25 d達(dá)到峰值，然后隨灌漿時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。3個(gè)品種的β-淀粉酶活性也呈降—升—降的趨勢(shì)，品種之間無(wú)顯著差異?；ê?0 d達(dá)到峰谷，花后30 d再次達(dá)到峰值，之后隨灌漿時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。

2.3　3個(gè)青稞品種籽粒直、支鏈淀粉和淀粉的積累

從表1可看出，青稞籽粒灌漿過(guò)程中直、支鏈淀粉的積累過(guò)程符合Logistic方程y=k/(1+eA+Bt)的擬合。由圖3 a和表1可知，昆侖12號(hào)的直鏈淀粉最終積累量、起始勢(shì)C0、最大灌漿速率Vmax、最小灌漿速率Vmin均高于北青6號(hào)，積累速率最大時(shí)日期Tmax和積累活躍生長(zhǎng)期D值在2個(gè)品種之間差異較小。說(shuō)明相對(duì)于北青6號(hào)，昆侖12號(hào)在籽粒灌漿期時(shí)直鏈淀粉的積累起始時(shí)間較早，且在整個(gè)灌漿過(guò)程中昆侖12號(hào)的直鏈淀粉積累速率快于北青6號(hào)，因此最終積累量高于北青6號(hào)。由此推斷，直鏈淀粉最終積累量是由積累啟動(dòng)時(shí)間的早晚和積累速率的快慢決定的。另外，甘墾5號(hào)淀粉的主要組成成分是支鏈淀粉，在本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到甘墾5號(hào)的直鏈淀粉。

從圖3 b可以看出，在灌漿前期，3個(gè)青稞品種支鏈淀粉積累量表現(xiàn)為昆侖12號(hào)>北青6號(hào)>甘墾5號(hào)；而在灌漿后期，各青稞品種支鏈淀粉積累量表現(xiàn)為北青6號(hào)>昆侖12號(hào)>甘墾5號(hào)。主要是因?yàn)楣酀{前期昆侖12號(hào)的C0大于北青6號(hào)和甘墾5號(hào)，而北青6號(hào)的Vmax、Vmin均大于昆侖12號(hào)和甘墾5號(hào)，且達(dá)到最高速率的時(shí)間較晚，而相對(duì)積累時(shí)間較長(zhǎng)，因此北青6號(hào)的最終積累量相對(duì)較高。甘墾5號(hào)的C0、Vmax、Vmin相對(duì)較小，在整個(gè)灌漿過(guò)程中，甘墾5號(hào)的支鏈淀粉積累量相對(duì)較低。支鏈淀粉最終積累量也是由積累時(shí)間的早晚和積累速率的快慢決定的。

圖3　3個(gè)青稞品種籽粒灌漿期淀粉(包括直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉)積累量的變化

表13個(gè)青稞品種支鏈淀粉和直連淀粉積累特征參數(shù)

淀粉組分品種logistic方程：y=k/(1+e(A+Bt))R2Tmax(d)D(d)Vmean[mg/(g·d)]Vmax[mg/(g·d)]C0支鏈淀粉甘墾5號(hào)y=9．3580/(1+e(3．7796-0．1942X))0．982319．467430．78450．3040．45420．2089Amylopectin北青6號(hào)y=19．0082/(1+e(4．1391-0．1770X))0．980923．388535．80410．53090．8410．2982昆侖12號(hào)y=16．3885/(1+e(3．3795-0．1681X))0．97720．107733．18080．49390．68860．5399直連淀粉北青6號(hào)y=5．8343/(1+e(11．5215-0．4972X))0．989623．170527．58930．21150．72530．0001Amylose昆侖12號(hào)y=7．0463/(1+e(10．5734-0．4536X))0．982323．312428．15690．25030．7990．0002

注：Tmax為速率最大時(shí)的日期；D為活躍生長(zhǎng)期(完成淀粉總積累量的90%)；Vmean為平均積累速率；Vmax為最大積累速率；C0為積累起始勢(shì)。

從圖3 c可看出，籽粒灌漿期北青6號(hào)與昆侖12號(hào)從開(kāi)花到花后20 d淀粉的積累量與花后25 d以后淀粉的積累量呈極顯著差異。而支鏈淀粉含量較高的甘墾5號(hào)在整個(gè)灌漿過(guò)程中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，但是淀粉積累量不存在時(shí)期上的顯著差異。這可能是由于品種之間的差異造成的。

2.4　淀粉代謝酶活性與淀粉積累速率的相關(guān)性分析

前人研究表明，在4個(gè)淀粉合成酶中除AGPP活性與淀粉積累速率極顯著正相關(guān)外，SSS、GBSS和SBE等單一酶活性的與淀粉積累速率并無(wú)必然聯(lián)系[15]。由表2可知，青稞籽粒灌漿期淀粉合成酶AGPP、SSS、GBSS和SBE活性與總淀粉積累速率和支鏈淀粉積累速率均呈極顯著或顯著正相關(guān)。而直鏈淀粉積累速率與 AGPP、GBSS和SBE呈顯著正相關(guān)，而SSS未呈現(xiàn)顯著性相關(guān)，可能是由于SSS主要參與支鏈淀粉合成導(dǎo)致的。而灌漿期總淀粉積累速率、直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率與3個(gè)青稞品種的α-淀粉酶呈負(fù)相關(guān)，與3個(gè)青稞品種的β-淀粉酶呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。α-淀粉酶與β-淀粉酶均為淀粉降解酶，說(shuō)明β-淀粉酶活性對(duì)灌漿期總淀粉積累速率、直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率的調(diào)節(jié)作用較α-淀粉酶的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)。

表2代謝酶活性與淀粉積累速率的相關(guān)性分析

酶品種直鏈淀粉積累速率支鏈淀粉積累速率淀粉積累速率AGPP甘墾5號(hào)-0．878??0．878??北青6號(hào)0．829?0．983??0．925??昆侖12號(hào)0．6680．934??0．871?SSS甘墾5號(hào)-0．857?0．857?北青6號(hào)0．5560．848?0．838?昆侖12號(hào)0．570．886??0．841?GBSS甘墾5號(hào)-0．952??0．592??北青6號(hào)0．748?0．854?0．924??昆侖12號(hào)0．751?0．993??0．970??SBE甘墾5號(hào)---北青6號(hào)0．765?0．878??0．935??昆侖12號(hào)0．760?0．966??0．944??α?淀粉酶甘墾5號(hào)--0．0066-0．0066北青6號(hào)-0．0627-0．3668-0．2725昆侖12號(hào)-0．187-0．2947-0．3272β?淀粉酶甘墾5號(hào)--0．8621?-0．8621?北青6號(hào)-0．7543?-0．7687?-0．8522?昆侖12號(hào)-0．9601??-0．9355??-0．9601??

注：“*”、“**”分別代表0.05和0.01顯著性水平。

3　討　論

關(guān)于AGPP、SSS、GBSS和SBE這幾種淀粉合成的關(guān)鍵酶，前人在水稻[12]、小麥[13]、玉米[14]等多種籽粒淀粉中淀粉合成酶作用的研究相對(duì)較多，且不同外界環(huán)境條件[15](包括溫度、水分、氮肥)、不同品質(zhì)[16]中淀粉合成酶的活性也不盡相同。本試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，青稞籽粒灌漿期支鏈淀粉積累速率和總淀粉積累速率與4種淀粉合成酶的活性變化均呈顯著或極顯著正相關(guān)。本試驗(yàn)中所用青稞材料根據(jù)總淀粉含量排序依次是北青6號(hào)>昆侖12號(hào)>甘墾5號(hào)，相關(guān)性分析表明，AGPP的酶活性變化與淀粉的積累速率(包括支鏈淀粉積累速率、直鏈淀粉積累速率及總淀粉積累速率)呈顯著或極顯著正相關(guān)，從而說(shuō)明較高的AGPP活性為淀粉積累量的增加提供了更強(qiáng)的供給能力。因此，AGPP酶在提高青稞淀粉含量中起著關(guān)鍵性的作用，這與曹穎妮[2]的研究結(jié)果相一致。

鄧萬(wàn)洪等研究發(fā)現(xiàn)，小麥籽粒直鏈淀粉含量與Waxy蛋白含量呈高度正相關(guān)，利用反義RNA技術(shù)沉默GBSS基因得到GBSS轉(zhuǎn)基因植株的高代品系，其GBSS酶活性與直鏈淀粉含量均極低[16]。本研究結(jié)果與前人的研究一致，GBSS酶活性與直鏈淀粉合成密切相關(guān)，與直鏈淀粉合成密切相關(guān)，與直鏈淀粉積累速率顯著相關(guān)，且直鏈淀粉含量較高的青稞GBSS酶活性較高。

王月福等認(rèn)為，如果SSS酶活性越高，利用底物ADPG合成支鏈淀粉的能力就越強(qiáng)[17]。本試驗(yàn)中支鏈淀粉含量高的甘墾5號(hào)其SSS活性也較高，相關(guān)性分析表明， SSS的酶活性變化與支鏈淀粉積累速率呈極顯著正相關(guān)，同時(shí)AGPP和SBE的酶活性變化也同樣與支鏈淀粉積累速率呈顯著正相關(guān)，從而可以推斷，支鏈淀粉的合成可能是由AGPP、SSS、SBE 3個(gè)酶協(xié)同完成的，而SSS酶是支鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶。

谷類作物籽粒中的支鏈淀粉是在SBE與SSS共同作用下形成的，并且對(duì)支鏈淀粉結(jié)構(gòu)形成起重要作用[18]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青稞籽粒灌漿期SBE活性與直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率均呈顯著正相關(guān)，這說(shuō)明SBE不僅參與支鏈淀粉的合成，也參與直鏈淀粉的合成。且SBE的活性值接近或滯后于SSS活性峰值，由此推斷，SSS酶活性在最終支鏈淀粉積累量的過(guò)程中起著決定性的作用，而SBE主要參與支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的形成。

谷類中α-淀粉酶與β-淀粉酶在籽粒灌漿期的重要性已經(jīng)有比較普遍的闡述[19]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，灌漿期總淀粉積累速率、直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率與3個(gè)青稞品種的α-淀粉酶呈負(fù)相關(guān)，與3個(gè)青稞品種的β-淀粉酶呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。α-淀粉酶與β-淀粉酶均為淀粉降解酶，說(shuō)明β-淀粉酶活性對(duì)灌漿期總淀粉積累速率、直鏈淀粉和支鏈淀粉積累速率的調(diào)節(jié)作用較α-淀粉酶的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)。

灌漿初期淀粉合成酶(AGPP、GBSS、SSS、SBE)活性較小，而淀粉降解酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶)活性較強(qiáng)，淀粉合成能力較弱，合成的淀粉部分被α-淀粉酶和β-淀粉酶分解為葡萄糖、麥芽糖、α-1,6糖苷鍵的糊精和極限糊精，淀粉的合成速率較低，淀粉的積累量相對(duì)較少；隨著籽粒的灌漿進(jìn)行，淀粉合成酶AGPP、GBSS、SSS和SBE活性均逐漸增大，淀粉合成速率也隨之上升，從而使得淀粉快速積累，淀粉分解酶α-淀粉酶和β-淀粉酶分解方向活性緩慢下降，籽粒中淀粉的合成速率大于分解速率，淀粉整體合成速率加快，導(dǎo)致淀粉大量積累；乳熟期以后，α-淀粉酶和β-淀粉酶分解方向活性有所回升，AGPP、GBSS、SSS和SBE合成方向活性下降，籽粒內(nèi)的合成速率小于分解速率，淀粉整體合成速率減慢，但淀粉繼續(xù)積累。青稞籽粒灌漿過(guò)程中淀粉含量積累是由于淀粉合成酶活性的增強(qiáng)，而不是分解酶活性的減弱。因此，青稞籽粒中淀粉積累是淀粉代謝酶(合成和分解方向)綜合作用的結(jié)果。

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