侯維海　王建林　胡　單　旦　巴

(西藏農(nóng)牧學(xué)院高原作物分子育種實驗室， 林芝　860000)

青稞(Hordeum vulgare Linn.var.nudum Hook.f.)又稱裸大麥，是西藏高原最古老的作物之一，也是西藏高原第一大糧食作物，廣泛分布于西藏高原多樣的生態(tài)區(qū)，主要分布范圍在北緯28°～30°，東經(jīng)88°～94°，海拔1 900～4 200 m的河谷地帶[1-3]。近年來，發(fā)現(xiàn)青稞具有豐富的膳食纖維、較高的保健組分和飼用價值，在釀酒、保健食品、再生能源等方面具有很大的開發(fā)潛力[4-5]，隨即青稞育種和利用逐漸受到人們重視。前人通過對西藏高原青稞種質(zhì)資源表觀性狀調(diào)查、細(xì)胞學(xué)鑒定、生理生化分析等，提出了西藏高原大麥變異極其豐富，是世界栽培大麥多樣性分布中心或初生起源中心之一[6-10]。隨后，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，有學(xué)者利用RAPD、SSR、ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)開展了青藏高原青稞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系預(yù)測和種質(zhì)鑒定工作[11-15]，但針對西藏高原青稞種質(zhì)遺傳多樣性的評價和研究仍較為薄弱和有限。西藏高原是青稞資源重要的基因庫，這里蘊(yùn)藏著多種現(xiàn)代農(nóng)業(yè)所急需的抗旱、抗寒、耐鹽堿、高品質(zhì)基因[16]，加強(qiáng)對西藏本地青稞資源的研究將有利于青稞資源的保護(hù)和促進(jìn)優(yōu)質(zhì)高抗青稞品種的選育和利用，有效緩解目前青稞遺傳基礎(chǔ)狹窄的困境，為西藏青稞育種親本選擇提供參考。

種子貯藏蛋白(Seed Storage Proteins，簡稱SSP)是指不具備代謝和結(jié)構(gòu)功能的種子蛋白，其組成由基因決定，在品種間存在明顯的差異，其電泳后條帶的多少及組合方式受基因型控制，幾乎不受外界環(huán)境因子的影響。因此，SSP在品種間組分上的差異可以反映基因型的不同，故被稱為品種的生化“指紋”[17]。SSP已被作為遺傳標(biāo)記廣泛應(yīng)用于四個方面：材料間遺傳多樣性分析；鑒定基因組關(guān)系；遺傳資源保存和育種相關(guān)的植物馴化；作為植物改良育種的手段[18]?；赟DS-PAGE種子蛋白質(zhì)電泳已經(jīng)成為一種有效工具解決植物分類、進(jìn)化問題、品種和變種的鑒定、種質(zhì)特征分析和補(bǔ)充評價相關(guān)信息等[19-20]。前人通過對小麥、大麥、辣椒、玉米、水稻、大豆，蠶豆、云豆等作物研究表明，不同生態(tài)類群、品種和材料間SSP是高度多態(tài)的，能夠反映材料大量的遺傳變異[21-23]。目前，有關(guān)青稞蛋白遺傳多樣性分析主要以醇溶蛋白進(jìn)行研究，例如曾興權(quán)[24]利用SDS-PAGE對347份西藏青稞農(nóng)家種、野生近緣種和育成品種進(jìn)行了醇溶蛋白的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)青稞育成品種的遺傳多樣性指數(shù)最高，地方品種次之，野生近緣種最小。馮宗云等[25]對106份西藏野生二棱大麥、野生瓶形大麥和野生六棱大麥3個醇溶蛋白位點的遺傳多樣性分析表明，不同棱型大麥蛋白位點有一定差異。閆敏[26]分析了18份西藏青稞育成品種醇溶蛋白的遺傳多樣性，共分離出22種相對遷移率不同的醇溶蛋白譜帶，認(rèn)為西藏青稞育成品種具有較豐富的醇溶蛋白遺傳多態(tài)性。迄今為止，僅零星描述西藏高原青稞醇溶蛋白遺傳多樣性的文章外，很少發(fā)現(xiàn)從種子清蛋白和球蛋白水平上研究西藏高原青稞種質(zhì)變異程度。本研究以54份西藏青稞農(nóng)家種和野生近緣種為材料，利用SDS-PAGE技術(shù)對種子蛋白多態(tài)性進(jìn)行分析，旨在探索西藏高原青稞種質(zhì)資源中蛋白亞基組成以及變異規(guī)律，篩選優(yōu)質(zhì)蛋白種質(zhì)，為青稞資源開發(fā)和優(yōu)良親本選配提供參考。

1　材料和方法

1.1　材料

參試材料為西藏青稞農(nóng)家種，野生近緣種共計54份，由西藏農(nóng)牧學(xué)院農(nóng)學(xué)教研室于2015年從西藏各縣市偏遠(yuǎn)農(nóng)村搜集獲得，并就地搜集經(jīng)度、緯度、海拔高度等地理信息數(shù)據(jù)(表1)。2016年3月20日在西藏農(nóng)牧學(xué)院農(nóng)場對54份參試材料進(jìn)行大田種植(北緯26°52′～30°40′，東經(jīng)92°09′～98°47′，海拔2 900 m)，小區(qū)面積2 m×3 m=6 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，采用常規(guī)田間管理措施，于材料成熟后，單獨采集5個麥穗，分類保存，自然晾干后脫粒，放通風(fēng)干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　主要儀器設(shè)備

臺式冷凍離心機(jī)：美國Beckman Coulter(貝克曼庫爾特)公司；DYCZ-24B型電泳儀:北京六一儀器廠。

表1　54份西藏青稞種質(zhì)材料基本信息

1.3　實驗方法

1.3.1青稞清蛋白、球蛋白的分離

參考宋曉敏等[27]、劉玉皎等[28]清蛋白、球蛋白的分離提取方法并作適當(dāng)改動。取4～5粒青稞種子置于預(yù)冷的研缽，搗碎并快速充分研磨至粉狀，稱取0.3 g青稞粉移入2 mL離心管，加入1.5 mL蒸餾水渦旋振蕩混勻，置于4 ℃冰箱提取30 min，期間每5 min充分振蕩混勻1次。6 500 r/min離心20 min，取上清液移入新離心管，為清蛋白，放4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?.3 g青稞粉移入2 mL離心管，加入1.5 mL 1 mol/L的NaCl溶解，放4 ℃冰箱提取30 min，期間每5 min充分振蕩混勻1次。6 500 r/min離心20 min，取上清液置4 ℃冰箱透析24 h得干粉，離心，用40 μL 1 mol/L的NaCl溶解干粉，為鹽容性蛋白，放4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2青稞清蛋白、球蛋白的SDS-PAGE電泳

分別取40 μL清蛋白和球蛋白，各加入10 μL上樣緩沖液(250 mmol/L，pH 6.8的Tris-HCl、10%SDS、0.5%溴酚藍(lán)、50%甘油、5% mLβ-巰基乙醇)，于100 ℃烘箱煮沸5 min，冷卻后，離心20 s，進(jìn)行點樣。電泳采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，以Tris-甘氨酸作為電極緩沖液，每份樣品上樣量為30 μL，凝膠厚度1.0 mm。在16 mA恒流條件下電泳，待指示劑遷移至凝膠底部后結(jié)束電泳。

清蛋白和球蛋白凝膠采用銀染色法，固定液(50%無水乙醇+12%冰醋酸+0.1%甲醛+38 mL雙蒸水)固定60 min；50%無水乙醇洗滌3次，5 min/次；敏化(0.02% Na2S2O3)1 min；雙蒸水漂洗3次，1 min/次；銀染(0.5% AgNO3，0.075%甲醇)20 min；雙蒸水漂洗2次，1 min/次；顯色(6% Na2CO3，0.000 4 Na2S2O3+0.05% HCHO)至帶型隱約看見，立即停止染色；終止反應(yīng)(50%無水乙醇+12%冰醋酸)。

1.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Quantity one軟件自動讀取青稞清蛋白和球蛋白電泳譜帶，人工輔助修正，按照同一位置，蛋白電泳條帶有，賦值為1，無賦值為0，生成0，1矩陣。通過NTSYS-pc 2.1軟件對生成的0，1矩陣進(jìn)行非加權(quán)類平均法進(jìn)行聚類，計算遺傳距離和遺傳相似系數(shù)。利用popgen 32軟件計算參試材料不同群見和不同群體內(nèi)某一位點的等位變異數(shù)、等位變異頻率、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、基因多樣性指數(shù)。通過Microsoft Excel計算出現(xiàn)頻率。

2　結(jié)果與分析

2.1　青稞清蛋白的SDS-PAGE分析

各參試材料籽粒清蛋白SDS-PAGE電泳圖見圖1所示，蛋白譜帶遺傳多樣性分析見表2和表3所示。參試材料經(jīng)SDS-PAGE電泳共分離出26條遷移率不同的譜帶，其范圍在10～21條，平均每份材料清蛋白譜帶條數(shù)為17.3條。蛋白譜帶數(shù)因材料而異，其中6、23、24、33和42號青稞材料分離出的清蛋白譜帶數(shù)最多，為21條，而7和43號材料譜帶最少，為10條。各遷移率不同的譜帶在參試材料中出現(xiàn)頻率為25.93%～100%，其中6、9、21、24號譜帶在參數(shù)材料中均有出現(xiàn)，其出現(xiàn)頻率為100%，為共有帶；13號譜帶出現(xiàn)頻率最低，為25.93%。參試材料有效等位基因數(shù)(ne)為1.0～1.99；多樣性指數(shù)(H)為0～0.5；Shannon’s信息指數(shù)為0～0.69。這些數(shù)據(jù)表明54份來源不同的西藏青稞資源球蛋白譜帶存在豐富的變異類型。

圖1　西藏青稞材料籽粒清蛋白和球蛋白SDS-PAGE電泳

2.2　青稞球蛋白的凝膠電泳分析

參試材料球蛋白SDS-PAGE電泳圖見圖1a所示，球蛋白遺傳多樣性分析見表2所示。54份西藏青稞共分離出遷移率不同的蛋白譜帶31條，變異范圍為12～26條，平均每份材料蛋白譜帶為21條，其中13、28和44號青稞材料分離出的球蛋白譜帶數(shù)最多，為26條，而3、11、15和30號青稞材料分離出的蛋白譜帶最少，為12或13條(表2、表4)。遷移率不同的31條譜帶在54份參試材料中出現(xiàn)的頻率為15.63%～100%，其中9、12、13、28、29號譜帶在參數(shù)材料中均有出現(xiàn)，其出現(xiàn)頻率為100%，為共有帶；23號譜帶出現(xiàn)頻率最低，為15.63%。參試材料有效等位基因數(shù)(ne)、多樣性指數(shù)(H)為0～0.5；Shannon’s信息指數(shù)與清蛋白數(shù)據(jù)相似。這些數(shù)據(jù)表54份來源不同的西藏青稞資源球蛋白譜帶存在豐富的變異類型。

表2　54份西藏青稞材料種子SDS-PAGE電泳譜帶統(tǒng)計

表3　54份青稞材料種子清蛋白譜帶遺傳多樣性分析

表4　54份青稞材料種子球蛋白譜帶遺傳多樣性分析

2.3　聚類分析

利用NTSYS-PC軟件采用非加權(quán)類平均聚類法(UP-GMA)對54份青稞材料清蛋白和球蛋白譜帶進(jìn)行聚類分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)參試材料遺傳相似系數(shù)(GS)變異范圍在0.71～0.96，其中1號和46號材料間的相似系數(shù)最大，為0.96，其次為2號和47號，其相似系數(shù)為0.955，表明這兩組材料遺傳背景差異極小，親緣關(guān)系最近。其他材料間有一定距離的遺傳差異。根據(jù)GS值為0.71水平上可將參試材料聚為一個類群，GS在0.775水平上將參試材料聚為8個類群，第I類為1份材料；第Ⅱ類群為1份材料；第Ⅲ類群有1份材料，分為兩個大的亞群；第Ⅳ類群為3份材料；第Ⅴ類群有1份材料；第Ⅵ類群有8份材料；第Ⅶ類群有3份材料；第Ⅷ類群為最大的類群，有29份材料，GS在0.79水平上，可將第Ⅷ類群分為3個小亞群。聚類分析發(fā)現(xiàn)來自西藏相似生態(tài)地理區(qū)位的青稞地方種、農(nóng)家種并未聚為一類，材料間互相交叉聚類。表現(xiàn)出對于參試材料蛋白的遺傳距離與地理來源之間無明顯關(guān)系。這可能與西藏多變的地理環(huán)境因素有關(guān)，表明來源于西藏不同區(qū)縣的清蛋白農(nóng)家種、地方種間遺傳背景差異較大。

2.4　不同海拔梯度種質(zhì)群間的遺傳多樣性差異

據(jù)參試材料采集地海拔高度，將54份青稞材料分為4個海拔梯度類群，即海拔低于3 000 m的類群、海拔高度在3 000～3 500 m的類群、3 500～4 000 m的類群和>4 000 m的類群。對各類群譜帶進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)4個類群間各考察參數(shù)均表現(xiàn)出一定的差異(表5)，表現(xiàn)出隨著海拔高度的增加，觀測等位基因數(shù)(na)、有效等位基因數(shù)(ne)、基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)呈有規(guī)律增加。這一結(jié)果暗示著，在西藏高原地區(qū)隨著海拔高度的增加，使得青稞遺傳變異相應(yīng)增大。此結(jié)果也印證了在海拔3 500～4 000 m的日喀則、山南等西藏高原青稞主產(chǎn)區(qū)，青稞種質(zhì)在長期的栽培馴化和人為選育過程中，遺傳資源變得豐富。此外，分布于海拔>4 000 m的極端惡劣環(huán)境下，青稞產(chǎn)生了極其豐富變異。

54份青稞材料類群間基因多樣性指數(shù)(Ht)是0.322 3，類群體內(nèi)基因多樣性指數(shù)(Hs)是0.292 9，基因變異的平均系數(shù)(Gst)是0.091 3,群體估計的基因流(Nm)是4.797 1(表6)。

圖2　54份西藏青稞種質(zhì)材料清蛋白和球蛋白亞基帶型N-J進(jìn)化樹

表5　不同海拔梯度的清蛋白生態(tài)類群遺傳多樣性分析

海拔高度/m資源份數(shù)觀測等位基因數(shù)(na)/個有效等位基因數(shù)(ne)/個基因多樣性指數(shù)(H)Shannons信息指數(shù)(I)多態(tài)性譜帶數(shù)量/個多態(tài)性帶百分率/%<300031.49±0.501.36±0.410.20±0.220.29±0.312849.123000～350091.72±0.451.52±0.410.29±0.210.42±0.294171.933500～4000201.78±0.421.55±0.390.31±0.190.45±0.274477.19>4000221.84±0.371.60±0.340.34±0.720.50±0.244884.21平均—1.84±0.371.59±0.340.34±0.710.49±0.2440.2570.61

表6　54份青稞材料基因多樣性評價

3　討論與結(jié)論

研究物種的遺傳變異有助于解析基因庫和遺傳差異，鑒定物種的親緣關(guān)系和相似性，并能更全面的比較品種特征，對挖掘優(yōu)異種質(zhì)資源和新品種選育具有重要意義[7]。前人利用蛋白質(zhì)、DNA分子標(biāo)記、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)和表型特征等方法對小麥、大豆、玉米等作物的遺傳變異和品種進(jìn)行了鑒定[29-32]。本研究通過SDS-PAGE方法對來自西藏不同生態(tài)區(qū)的56份青稞材料間SSP的遺傳變異鑒定，分析材料間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，有助于了解西藏青稞材料的遺傳背景，拓寬親本譜，為優(yōu)選親本組配提供奠定基礎(chǔ)。

前人利用SDS-PAGE方法對青藏高原青稞或大麥種質(zhì)資源蛋白遺傳多樣性分析主要集中于醇溶蛋白，認(rèn)為該地區(qū)存在非常豐富的醇溶蛋白等位變異。例如，Yin等[33]對西藏的211份近緣野生大麥種質(zhì)的醇溶蛋白多態(tài)性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來源于以色列、約旦等地的大麥材料。侯永翠等[34]對來自西藏及青海省36個不同行政縣的105份近緣野生大麥的醇溶蛋白SDS-PAGE電泳、共分離出36條不同譜帶,譜帶變幅在5～24條，平均14條，未發(fā)現(xiàn)共有帶，多態(tài)性達(dá)到100%，醇溶蛋白譜帶聚類分析顯示,材料的遺傳相似系數(shù)(GS)變異范圍為0.182～0.966，平均值為0.580。閆敏等[26]對18份西藏青稞育成品種進(jìn)行醇溶蛋白遺傳多樣性研究，共分離出22種不同譜帶，平均等位變異數(shù)為10個，傳相似系數(shù)(GS)變異范圍為0.00～0.61。曾興權(quán)[24]對347份西藏青稞種質(zhì)材料進(jìn)行了醇溶蛋白的遺傳多樣性分析，共分離得到169條不同譜帶；譜帶變幅在2～17條，平均7.59條，平均遺傳相似系數(shù)為0.453 8，變化范圍為0.25～1.0。本研究利用SDS-PAGE對來自西藏不同生態(tài)區(qū)的54份青稞資源籽粒清蛋白和球蛋白遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，共分離出遷移率不同的清蛋白譜帶26種，變幅在10～21條，平均17.3條；球蛋白譜帶31條，其變幅在12～26，平均21條；清蛋白和球蛋白譜帶的遺傳相似系數(shù)變異范圍在0.71～0.96。此結(jié)果與前人利用SDS-PAGE分離出的青稞醇溶蛋白遺傳多樣性相比，分離出的蛋白譜帶略多，但遺傳多樣性略低，這可能歸咎于本實驗采用痕量銀染法，與常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)顏色相比，其顯色敏感型約為后者的10倍，同時推測清蛋白和球蛋白較醇溶蛋白穩(wěn)定，發(fā)生遺傳變異的可能性低有關(guān)，也支持了前人的研究結(jié)果，認(rèn)為醇溶蛋白具有較多的突變[26]。由此，建議今后全面解析青稞籽粒蛋白的遺傳多樣性，應(yīng)全面分析清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的遺傳多樣性。

本研究根據(jù)54份西藏青稞資源種子清蛋白和球蛋白譜帶差異，利用聚類分析發(fā)現(xiàn)，在相似系數(shù)為0.775水平上，將54份青稞種質(zhì)材料分8個類群，不同類群的材料間并未表現(xiàn)出明顯的地域分布，這可能與西藏地區(qū)特殊的地理環(huán)境條件有關(guān)，不同區(qū)縣間環(huán)境條件迥異，且大山阻隔了青稞種質(zhì)間的基因流。同時在不同海拔高度的生態(tài)環(huán)境中，青稞種質(zhì)資源遺傳多樣性表現(xiàn)出一定的規(guī)律，即隨著海拔高度增加，評價青稞資源的遺傳多樣性各指標(biāo)均呈增加趨勢。這表明，隨著海拔高度增加，氧濃度逐漸下降，氣壓下降，輻射強(qiáng)度增加，干旱少雨等，各種誘變因素增加，導(dǎo)致青稞種質(zhì)資源變異頻率提高，加之在海拔3 500～4 000 m西藏青稞主產(chǎn)區(qū)，在長期的人工馴化和種質(zhì)資源的人為流動，導(dǎo)致天然群體混雜度提高，使得青稞遺傳多樣性增加。

54份青稞種質(zhì)基因遺傳多樣性(H)為0.34，暗示著所有參試材料間遺傳變異的34%，而剩余的64%的遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)。Yeh等[35]認(rèn)為Gst范圍在0.151～0.25代表大的遺傳差異，基于此范圍，西藏清蛋白4個地理生態(tài)群體表現(xiàn)出較弱的群體間分化。本研究估算的基因流Nm為4.797 1，Wright[36]認(rèn)為Nm低于1暗示著群體因為遺傳漂移開始分化，而Mcdermott等[37]認(rèn)為Nm低于0.5暗示著群體因基因漂移而產(chǎn)生廣泛的遺傳多樣性。本試驗Nm遠(yuǎn)高于1，暗示西藏不同生態(tài)類群的青稞資源處于分化進(jìn)程中。

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