李婷婷　王　旭　劉　芳　張　魯　劉天一　于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱　150030)

于殿宇，男，1964年出生，教授，糧油精深加工技術(shù)

在酶法脫膠工藝過程中，膠體物質(zhì)主要是指磷脂[1]。磷脂分為水化磷脂(Hydratable Phosph-olipids，HP)和非水化磷脂(Non-hydratable Phospholipids，NHP)[2-3]。水化磷脂包括磷脂酰膽堿(卵磷脂，PC)、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂，PE)、磷脂酰肌醇(PI)、縮醛磷脂酰膽堿(APC)等[4-5]，都含有極性較強的基團，因此具有比較強的親水性，與水接觸后能與水形成水合物，可以從油中析出并經(jīng)過離心分離除去。在毛油進行脫膠時，水化磷脂可以通過水化脫膠、酸法脫膠、特殊脫膠等傳統(tǒng)的脫膠方法除去[6-7]。但是，大豆毛油中非水化磷脂是以磷脂酸和溶血磷脂酸的鈣鎂鹽的形式存在的[8]，非水化磷脂具有明顯的疏水性，水化脫膠中較難與水結(jié)合，去除較為困難，增加毛油的損耗和生產(chǎn)成本[9]。所以生產(chǎn)中應盡量避免產(chǎn)生非水化磷脂。

在大豆油預處理過程中，大豆需要軟化以增加彈塑性，減少軋坯時的粘輥現(xiàn)象，保證坯片的質(zhì)量，提高浸出率。由于大豆中磷脂酶D的存在使非水化磷脂含量增多，控制大豆豆瓣中磷脂酶D的活性可以很好的控制非水化磷脂的含量[10-11]。因而，利用飽和蒸汽對軟化后的大豆豆瓣進行處理，研究其對大豆豆瓣中磷脂酶D活性的影響，以期降低毛油中的非水化磷脂含量。

本實驗扦取破碎后的大豆豆瓣樣品，在確保大豆豆瓣氮溶解指數(shù)(Nitrogen solubility index，NSI)變化不大的條件下，對豆瓣進行加溫軟化，然后向軟化后豆瓣中通入飽和蒸汽進行濕熱處理，研究破碎程度、飽和蒸汽溫度和蒸汽處理時間對大豆豆瓣中磷脂酶D活性的影響，通過溶劑萃取制得大豆毛油，研究大豆毛油中非水化磷脂的含量，以期更好地指導實際生產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

破碎后不同大小的大豆豆瓣樣品[含水量(12±0.2)%]：黑龍江九三康諾有機農(nóng)產(chǎn)品科技有限公司；乙醚、高氯酸、氯化鈣、氫氧化鈉、丙酮、正丙醇、乙酸鈉、石油醚、雷氏鹽等均為分析純：國藥集團。

LG10-2.4A型高速離心機：北京眾益中和生物有限公司；F2102型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；JB-3型定時恒溫磁力攪拌器：上海雷磁新涇儀器有限公司；LDR3-0.7R(Ⅱ)蒸汽發(fā)生器：溫州市鹿城江心服裝機械有限公司；DHG-9123A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.2　方法

1.2.1大豆中磷脂酶D的測定方法

酶的制備：把豆瓣粉碎，稱取5.0 g粉末樣品在低溫下進行脫脂。移入布氏漏斗中，真空抽濾。并用石油醚沖洗濾餅。室溫下干燥。進一步研細，重復操作過程。把大豆粉浸泡后進行浸提，得到粗制大豆粉，通過離心分離，使其與不溶性雜質(zhì)分離，取上層清夜用50%飽和度的硫酸銨進行蛋白質(zhì)鹽析沉淀，沉淀物用水溶解得到酶液[12]。

酶活力的測定：將30.0 mL的底物加入帶塞的試管中，在25 ℃水浴鍋中，溫度平衡后，加入稀釋10倍的酶液5.0 mL，在反應開始時，加入1.0 mL乙醚，混勻后于25 ℃保溫20 min，反應用2.0 mL高氯酸終止。把混合物移入100.0 mL的分液漏斗，加入10.0 mL乙醚，劇烈振蕩使乙醚可充分萃取未反應的磷脂和產(chǎn)物磷脂酸，用乙醚反復萃取3次，將乙醚分離后，進行膽堿測定[13]。

1.2.2大豆豆瓣軟化過程對磷脂酶D活性變化趨勢的研究

將經(jīng)破碎處理的大豆豆瓣放入不銹鋼鍋內(nèi)，水浴鍋內(nèi)溫度為65 ℃，間隔一段時間翻轉(zhuǎn)物料，軟化時間20 min，并進行大豆豆瓣中磷脂酶D活性的測定，測定方法同1.2.1。

1.2.3 飽和蒸汽處理對大豆豆瓣中磷脂酶D活性變化趨勢的研究

選取規(guī)格為直徑28 cm，高13 cm的不銹鋼鍋，下開口直徑為4 cm以利于蒸汽通入，上開口直徑6 cm以利于蒸汽通出，內(nèi)置60目不銹鋼蒸屜網(wǎng)，需將整個不銹鋼蒸屜網(wǎng)覆蓋上大豆豆瓣防止短路，利用蒸汽發(fā)生器將飽和蒸汽處理通入鍋底，間隔一段時間翻轉(zhuǎn)物料，對大豆豆瓣進行飽和蒸汽處理，測定不同條件下大豆豆瓣中磷脂酶D的活性，測定方法同1.2.1。

1.2.4大豆豆瓣中油脂的萃取

采用索氏抽提法，對軟化后的大豆豆瓣以及1.2.3中經(jīng)飽和蒸汽處理后得到的大豆豆瓣，分別進行油脂的萃取[14-15]。

1.2.5響應面優(yōu)化飽和蒸汽處理最佳參數(shù)

綜合單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken模型，對破碎程度(A)、飽和蒸汽溫度(B)、通汽時間(C)3個因素進行優(yōu)化，以大豆豆瓣中磷脂酶D活性(Y)為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，使用Design Expert 8.0.6設(shè)計響應面實驗以優(yōu)化蒸汽處理參數(shù)。響應面因素水平編碼見表1。

表1　Box-Behnken設(shè)計實驗因素水平及編碼

1.2.6大豆豆瓣中NSI值的測定

取1.2.3中大豆豆瓣，對其進行大豆豆瓣中蛋白氮含量的測定。并利用公式計算NSI值。

大豆蛋白氮含量測定方法為GB 5511—2008《谷物和豆類氮含量測定》

1.2.7大豆毛油中非水化磷脂含量的測定

取一定量的大豆毛油，加熱至80 ℃，加入大豆毛油中磷脂含量10倍質(zhì)量的等溫蒸餾水，在較低轉(zhuǎn)速下攪拌30 min后離心20 min，得到水化脫膠油。采用測定油脂水化前后磷脂總含量的方法，即水化后磷脂含量占水化前磷脂含量的百分比，從而得出非水化磷脂所占比例[16]。

磷脂含量測定參照GB/T 5537—2008《糧油檢驗磷脂含量的測定(鉬藍比色法)》

1.2.8大豆毛油脫膠油精煉率的計算

參照楊亞濟[17]的方法，計算制得大豆毛油進行水化脫膠的精煉率。

2　結(jié)果與討論

2.1　單因素對磷脂酶D活性的影響

2.1.1大豆豆瓣中磷脂酶D活性

將工廠中扦取的破碎后的大豆豆瓣經(jīng)軟化后置于燒杯中，對其大豆豆瓣中磷脂酶D的活性進行測定，測定結(jié)果為0.76 U/mg·min。

2.1.2大豆豆瓣的破碎程度對豆瓣中磷脂酶D活性的影響

將大豆豆瓣置于燒杯中，以大豆豆瓣大小作為衡量破碎程度的指標，篩選出破碎為4、5、6、7、8瓣的大豆豆瓣樣品置于水浴鍋內(nèi)的不銹鋼鍋中進行軟化，溫度為65 ℃，軟化時間20 min。取軟化后大豆豆瓣置于1.2.3的鍋中，通入0.14 MPa、110 ℃的飽和蒸汽，通汽時間為1.5 min。分別取2.0 g大豆豆瓣，測定其大豆豆瓣中磷脂酶D活性。測定結(jié)果見圖1。

圖1　破碎程度對酶活性的影響

由圖1可知，不同的破碎程度對大豆豆瓣中磷脂酶D的活性有顯著影響。當大豆豆瓣的破碎程度為4瓣時，其磷脂酶D的活性最強，這可能是由于大豆豆瓣尺寸較大而導致在飽和蒸汽濕熱處理過程中不充分，飽和蒸汽難以傳質(zhì)至大豆豆瓣中心，使大豆豆瓣中磷脂酶D的活性分布不均。當大豆豆瓣的破碎程度為6瓣，其磷脂酶D的活性變化趨勢不明顯，即此時大豆豆瓣經(jīng)飽和蒸汽濕熱處理時可以充分受熱，大豆豆瓣濕熱處理較為徹底。當大豆豆瓣的破碎程度為7～8瓣時，其磷脂酶D的活性雖達到最低值，但由于此時樣品尺寸過小，不宜于后續(xù)的軋坯操作。因此，本實驗選取最佳破碎程度為6瓣的大豆豆瓣。

2.1.3飽和蒸汽溫度對大豆豆瓣中磷脂酶D活性的影響

取破碎為6瓣的大豆豆瓣置于水浴鍋內(nèi)的不銹鋼鍋中進行軟化，溫度為65 ℃，軟化時間20 min。取軟化后大豆豆瓣置于1.2.3的鍋中，調(diào)節(jié)蒸汽發(fā)生器的壓力，在不同壓力下，分別通入100、105、110、115、120 ℃的飽和蒸汽，通入飽和蒸汽時間為1.5 min。分別取2.0 g大豆豆瓣測定磷脂酶D活性。測定結(jié)果見圖2。

圖2　 飽和蒸汽溫度對酶活性的影響

由圖2可知，隨著蒸汽溫度逐漸升高，酶的活性逐漸降低。當溫度處于100～105 ℃時，隨著溫度升高，大豆豆瓣中磷脂酶D活性的變化趨勢較明顯，這可能是因為溫度對酶活性的作用較大，使部分酶發(fā)生變性，因而酶活性降低。當溫度處于105～115 ℃時，大豆豆瓣中磷脂酶D活性的變化趨勢不明顯，此原因可能是飽和蒸汽溫度較高，大部分酶已被鈍化，因此酶活隨溫度的變化較小。當溫度處于120 ℃時，雖然溫度越高，酶活損失越大，溫度過高時，會影響大豆豆瓣蛋白的NSI，繼而影響大豆豆瓣的質(zhì)量。因此在不影響大豆豆瓣中蛋白質(zhì)的性質(zhì)情況下，本實驗選擇通入蒸汽的最佳溫度為110 ℃。

2.1.4通入飽和蒸汽時間對大豆豆瓣中磷脂酶D活性的影響

取破碎為6瓣的大豆豆瓣置于水浴鍋內(nèi)的不銹鋼鍋中進行軟化，溫度為65 ℃，軟化時間20 min。取軟化后大豆豆瓣置于1.2.3的鍋中，通入110 ℃的飽和蒸汽，通汽時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 min。分別取2.0 g大豆豆瓣測定磷脂酶D活性。測定結(jié)果見圖3。

圖3　 通入飽和蒸汽時間對酶活性的影響

由圖3可知，隨著通入飽和蒸汽時間的延長，酶的活力逐漸減弱。當通汽時間在0.5～1 min時，大豆豆瓣中磷脂酶D活性降低趨勢緩慢，可能是由于此時通入飽和蒸汽時間較短，大部分酶沒有被滅活。當時間為1～1.5 min時，隨著通入飽和蒸汽時間的延長大豆豆瓣中磷脂酶D活性下降較快，即溫度一定時，通汽時間越久，酶活損失越明顯。而在1.5 min以后，酶活降低趨勢又趨于平緩，如若再延長時間，則會使大豆豆瓣中的蛋白NSI降低，影響產(chǎn)品質(zhì)量。因而選取通入飽和蒸汽最佳時間為1.5 min。

2.2　響應面優(yōu)化飽和蒸汽濕熱處理豆瓣最佳條件

綜合單因素實驗的結(jié)果，以破碎程度(A)、飽和蒸汽溫度(B)、通汽時間(C)3個因素進行優(yōu)化，以大豆豆瓣中磷脂酶D活性(Y)為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，使用Design Expert 8.0.6設(shè)計響應面實驗以優(yōu)化飽和蒸汽處理豆瓣條件。響應面實驗方案與結(jié)果見表2。對表2進行擬合的二次模型方差分析見表3。

表2　Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

表3　回歸方程的方差分析表

注：**差異極顯著(P<0.01)；*差異顯著(P<0.05)。

由表3知，實驗共進行17次，其中析因?qū)嶒灋?2次，中心實驗為5次。采用Design expert 8.0.6軟件對表中數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，各實驗因子對響應值的影響可用如下函數(shù)表示：

Y=0.54-0.023A-0.011B-0.024C+(5.000E-003)AB+0.01AC+0.013BC+0.040A2+0.018B2+0.013C2。

圖4　大豆豆瓣中磷脂酶D活性的響應面圖

從圖4中可以看出，破碎程度、飽和蒸汽溫度、通汽時間在兩兩交互時，保持其中2個變量不變，隨著另外2個變量的增加，大豆豆瓣中磷脂酶D活性總體上呈現(xiàn)降低的趨勢。

對方程進行分析求解，以大豆豆瓣中磷脂酶D活性的變化趨勢得到經(jīng)飽和蒸汽處理大豆豆瓣的最佳處理工藝條件為：破碎程度6.17瓣、飽和蒸汽溫度109.93 ℃、通汽時間1.93 min?？紤]到實際操作的方便，將飽和蒸汽通入大豆豆瓣的最佳處理條件修改為破碎程度6瓣、飽和蒸汽溫度110 ℃、通汽時間2 min，在此條件下，飽和蒸汽處理后的大豆豆瓣中磷脂酶D活性的理論預測值為0.529 U/mg·min，實際測得大豆豆瓣中磷脂酶D活性為0.54 U/mg·min，表明該模型可行。且與蒸汽處理前相比，酶活損失為28.9%。

2.3　飽和蒸汽處理時間對大豆豆瓣蛋白NSI的影響

由2.2可知，飽和蒸汽可以使大豆豆瓣中磷脂酶D的活性失活，但是當通入飽和蒸汽的量過多時，會使大豆豆瓣蛋白質(zhì)發(fā)生變性，因而影響后續(xù)產(chǎn)品質(zhì)量。本實驗主要以NSI對大豆豆瓣蛋白變性程度進行評價。通入飽和蒸汽的時間對大豆豆瓣蛋白的NSI有顯著影響[18]，因而本實驗采用0.14 MPa、110 ℃的飽和蒸汽，并以不同通汽時間對大豆豆瓣蛋白NSI的影響進行測定。結(jié)果見圖5。

圖5　通入蒸汽時間對NSI變化影響

由圖5可知，大豆豆瓣蛋白NSI隨著通入飽和蒸汽時間的延長而逐漸下降。大豆豆瓣蛋白NSI越低，則其質(zhì)量越差，因此本實驗選取的110 ℃、2 min的飽和蒸汽處理條件不僅可以使大豆豆瓣中磷脂酶D滅活，還可以保證大豆豆瓣蛋白NSI較高，從而不影響其質(zhì)量。

2.4　飽和蒸汽處理對大豆毛油中非水化磷脂含量影響

飽和蒸汽可以使大豆豆瓣中磷脂酶D鈍化，則必然會對毛油中非水化磷脂含量有一定的影響，本實驗中，測定以飽和蒸汽處理大豆豆瓣及未經(jīng)蒸汽處理大豆豆瓣制得的大豆毛油，其結(jié)果見圖6。

圖6　蒸汽處理前后對非水化磷脂含量變化影響

由圖6可知，未經(jīng)飽和蒸汽處理大豆豆瓣制得的大豆毛油中非水化磷脂約占磷脂總量的12.4%，氮溶解指數(shù)為91.4%。以飽和蒸汽處理大豆豆瓣制得的大豆毛油中非水化磷脂約占總磷脂含量的2.3%，相比之下，非水化磷脂含量減少，主要原因飽和蒸汽處理可以有效降低大豆豆瓣中磷脂酶D活性，阻止大豆豆瓣中磷脂酶D催化水解反應發(fā)生[19]，避免磷脂酸的產(chǎn)生，從而減少了毛油中非水化磷脂的含量。因而對軟化后大豆豆瓣進行飽和蒸汽處理，可以達到降低毛油中非水化磷脂的目的， 經(jīng)水化脫膠油脂精煉率提高了0.36%，效果較好。

3　討論

未經(jīng)飽和蒸汽處理的大豆豆瓣磷中脂酶D活性為0.76 U/mg·min，大豆豆瓣蛋白NSI為91.4%，大豆毛油中非水化磷脂質(zhì)量分數(shù)高達12.4%。將軟化后的大豆豆瓣進行飽和蒸汽處理，在最佳條件下，大豆豆瓣中磷脂酶D活性降低了28.9%，大豆豆瓣蛋白NSI僅降低了4.2%，對大豆豆瓣的蛋白質(zhì)量影響較小。對萃取毛油中非水化磷脂含量降低了10.1%，經(jīng)水化脫膠大豆脫膠油的精煉率提高了0.36%。由此可見，通過對大豆軟化后的豆瓣進行飽和蒸汽處理，對大豆豆瓣中磷脂酶D的活性影響較大，從而可以更好地指導實際生產(chǎn)。

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