李強　王紅義　段俊國

近年來，大量的臨床及實驗研究報道了單味中藥或其提取物具有視功能保護(hù)作用，在治療效果和不良反應(yīng)等方面較西藥更具綜合優(yōu)勢。其中，銀杏葉提取成分(Ginkgo biloba Extract，GBE )用于視神經(jīng)保護(hù)的研究引起了人們極大的興趣。本實驗通過建立體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞模型，采用MTT比色法，進(jìn)行了銀杏葉提物對保護(hù)作用有效濃度的篩選，為下一步在離子通道水平研究其保護(hù)作用提供實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1動物

SD乳鼠(1日齡)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(生產(chǎn)合格證：川實動管質(zhì)第99～11號)，2只，雌雄不拘，質(zhì)量約5g～7g，母乳喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件保持在室溫18℃～24℃，相對濕度50%～70%，空氣流通。自然光線照明，12小時明-暗交替光照，晝夜循環(huán)。

SD乳大鼠的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①選擇同窩乳鼠；②皮膚無咬痕、潰瘍等損傷。

1.1.2儀器設(shè)備

Ti-U倒置相差顯微鏡(美國Nikon)；MDF- 382E型超低溫冰箱(日本SANYO)；BT125D電子天平(德國Sartorius)；Phenix型普通光學(xué)顯微鏡(江西鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司)；Milli-Q型去離子水系統(tǒng)(美國Millipore)；Megafuge1.0R型離心機(美國KendroHeraeus)； FORMA3110型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo)；25cm2培養(yǎng)瓶(美國COSTAR)；XB-K-25型血球計數(shù)板(浙江玉環(huán)五金光學(xué)儀器廠)；PB-10型精密PH計(德國Sartorius)；35mm培養(yǎng)皿(美國COSTAR)體式顯微鏡(日本Nikon)；DP-12型顯微數(shù)碼照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS)；ZHJH-C1209B型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)； 96孔培養(yǎng)板(美國COSTAR)；針芯式濾器(ф0.22um)(美國Millipore)；200目篩網(wǎng)(上海元象器械廠)等。

1.1.3試劑

Neurobasal Medium(美國Invitrogen Corporation)，Trypsin(美國Invitrogen Corporation)，Poly-D-lysine hydrobromide(美國SIGMA Corporation)，F(xiàn)etal Bovine Serum(美國Invitrogen Corporation)，DMEM(High Glucose)(美國Invitrogen Corporation)， HEPES(美國SIGMA Corporation)，B27(美國Invitrogen Corporation)， New Born Calf Serum(美國Invitrogen Corporation)，PBS(美國Invitrogen Corporation)，Hank's Balanced Salt Solution(美國Invitrogen Corporation)， Penicillin-Streptomycin(美國SIGMA Corporation)，Laminin(美國SIGMA Corporation)，L-Glutamine(美國Invitrogen Corporation)，銀杏葉提取物(GBE，由上海信誼百路達(dá)藥業(yè)有限公司提供)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，美國Peprotech Corporation)，二甲基亞砜(DMSO，美國SIGMA Corporation)，噻唑蘭(MTT，美國SIGMA Corporation)等。

1.2　方法

1.2.1體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞模型的建立

大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)：借鑒Kitano S等[1-4]和其他實驗室的方法，并加以改進(jìn)。

1.2.1.1培養(yǎng)器皿的鋪板

以0.1mg/ml多聚賴氨酸(Poly-D-lysine hydrobromide，PBS緩沖液稀釋)37℃包被96孔板、2cm×2cm蓋玻片、25cm2培養(yǎng)瓶、直徑35mm培養(yǎng)皿及直徑100mm培養(yǎng)皿，要完全覆蓋整個皿底。室溫包被2小時后，回收多聚賴氨酸；用PBS液漂洗3次，在通風(fēng)櫥內(nèi)干燥，待用。再以4ug/ml層粘連蛋白(laminin，PBS液稀釋)包被，也要完全覆蓋整個皿底。37℃過夜備用。

1.2.1.2大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)

將出生1天SD乳鼠2只浸在75%酒精中30s，注意全身浸濕，但注意頭部要適時晾干。用大剪刀迅速剪取頭部，置空的皿中稍晾干殘余酒精。左手夾持頭部，右手用直剪剪開眼裂周圍組織，暴露眼球。用彎剪彎鑷夾取眼球，放入已冰浴的且加有Penicillin-Streptomycin的 Hank's Balanced Salt Solution液中，體式顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜，用venus 剪剪碎組織，收集并轉(zhuǎn)移到離心管中，待組織沉降3min，吸除上層液體。用終濃度為0.125% Trypsin在孵育箱中消化15分鐘，其間搖兩次。然后取出，加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，以終止酶解。吹打數(shù)次。用220目網(wǎng)眼無菌鋼網(wǎng)濾過，1000r/min離心3分鐘。去上清液，加10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，小心用吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散均勻，制成細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡產(chǎn)生。計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml加入96孔板和預(yù)先置入2cm×2cm蓋玻片的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后用維持培養(yǎng)(97.5% Neurobasal Medium、2% B27、0.5% 200mM/L L-Glutamine)換液1次。2天后開始用維持培養(yǎng)基。并觀察其生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用有效濃度的研究

1.2.2.1體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作有效濃度的篩選

采用MTT法(噻唑蘭比色法)測定銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。MTT法，又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

MTT法實驗步驟：(1)取出生1天的SD乳鼠2只，制備成視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml加入預(yù)先包被Poly-D-lysine的96孔板。37℃、5%二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)。(2)48小時(細(xì)胞已貼壁)后，無血清培養(yǎng)液洗滌3次。隨機分組進(jìn)行實驗，共分9個組：0.01μg/ml GBE組，0.1μg/ml GBE組，1μg/ml GBE組，10μg/ml GBE組，100μg/ml GBE組，500μg/ml GBE組，1000μg/ml GBE組，50ng/ml BDNF組，空白對照組(control組)，每組10孔，每孔加入各100ul濃度梯度的藥物、陽性對照藥物(50ng/ml BDNF)、培養(yǎng)液(空白對照)，37℃孵箱培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察。(3)48小時后，加入100ul MTT(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)37℃孵箱培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察。(4)4小時后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。(5)每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的OD值，并在倒置顯微鏡下觀察(注：設(shè)置調(diào)零孔2個)。

1.2.2.2銀杏葉提取物對混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活率的測定

根據(jù)OD值計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(試驗組OD值-空白組OD值)/空白組OD值×100%

1.3　統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較用q檢驗(LSD法)。

2　結(jié)果

2.1　體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞模型的建立

2.1.1大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生長狀況

相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞于培養(yǎng)的3～4小時開始貼壁，貼壁后的細(xì)胞呈圓形，胞體中部較暗，光暈明顯。24～48小時細(xì)胞開始伸出粗細(xì)長短不等的突起。細(xì)胞呈多邊形，大多數(shù)細(xì)胞折光強，有聚集生長的現(xiàn)象；72小時后突起增多，并伸長。培養(yǎng)一周后，胞體折光降低。培養(yǎng)2～3周后存活細(xì)胞逐漸減少。見圖1～圖10。

2.1.2大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

圖1細(xì)胞于培養(yǎng)的4小時開始貼壁，貼壁后的細(xì)胞呈圓形，胞體中部較暗，光暈明顯(×200)圖2培養(yǎng)24h，細(xì)胞開始伸出粗細(xì)長短不等的突起，有聚集生長的現(xiàn)象(×200)圖3培養(yǎng)2d，細(xì)胞呈多邊形，突起漸長，大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)折光強，有聚集生長的現(xiàn)象(×200)圖4培養(yǎng)4d，細(xì)胞開始突起增多，并伸長；有聚集生長的現(xiàn)象(×200)圖5培養(yǎng)6d后，突起增多，并伸長，形成網(wǎng)狀(×200)圖6培養(yǎng)8d后，胞體折光降低(×200)圖7培養(yǎng)10d后，胞體折光降低開始有細(xì)胞凋亡(×200)圖8培養(yǎng)12d后，凋亡細(xì)胞增加(×200)圖9培養(yǎng)14d后凋亡細(xì)胞進(jìn)一步增加(×200)圖10培養(yǎng)16d后，存活細(xì)胞較少(×200)

2.2　不同濃度銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活的影響

MTT比色法對RNCs保護(hù)作用有效濃度進(jìn)行篩選，1000μg/mlGBE、500μg/mlGBE、100μg/mlGBE、10μg/mlGBE、1μg/mlGBE、0.1μg/mlGBE、0.01μg/mlGBE，50ng/mlBDNF各組與空白對照組的OD值分別為(0.57 ±0.09，0.74 ±0.10，0.74 ±0.12，0.57 ±0.07，0.58 ±0.10，0.46 ±0.10，0.34 ±0.07，0.81 ±0.06，0.35 ±0.06)。其中1000μg/mlGBE、500μg/mlGBE、100μg/mlGBE、10μg/mlGBE、1μg/mlGBE、0.1μg/ml GBE和50ng/ml BDNF各組與空白對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1，圖11。

2.3　MTT結(jié)晶沉積于視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的觀察

銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用有效濃度為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml。

3　討論

銀杏葉系銀杏科銀杏屬植物銀杏葉，是我國的特產(chǎn)植物。含黃酮類(約20余種)、萜類、酚類，有益微量元素和17種氨基酸等有效成分。國外較早生產(chǎn)的銀杏葉提取物商品名為金納多，其有效成份是24%的總黃酮和6%的萜類(銀杏內(nèi)酯和銀杏苦內(nèi)酯)。黃酮類化合物具有抗氧化作用而內(nèi)酯類具有抗血小板激活因子的作用[5]。自20世紀(jì)60年代以來各國學(xué)者對銀杏的成份及其藥理作用做了大量的工作。最初，人們用它治療冠心病、高血壓、心絞痛、動脈硬化等循環(huán)障礙疾病及腦功能減退、老年性癡呆、老年性記憶減退、衰老等與腦內(nèi)興奮毒性損傷相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6, 7]，得了一定的效果[8, 9]。后來經(jīng)過大量實驗和臨床證明，GBE還有顯著的視功能保護(hù)作用。目前GBE成為倍受關(guān)注的藥品[10]。

圖121000μg/mlGBE組加入MTT后生成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中(×200)圖13100μg/mlGBE組加入MTT后生成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中(×100)圖1410μg/mlGBE組加入MTT后生成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中(×200)圖1550ng/mlBDNF組加入MTT后生成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中(×400)圖16空白組加入MTT后，生成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中(×200)圖17二甲基亞砜溶解細(xì)胞中的甲瓚(×100)

表1不同濃度銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活的影響

GroupnODvalueLivability(%)50ng/mlBDNF100．81±0．06#1．331000μg/mlGBE100．57±0．09#0．65500μg/mlGBE100．74±0．10#1．12100μg/mlGBE100．74±0．12#1．1210μg/mlGBE100．57±0．07#0．651μg/mlGBE100．58±0．10#0．660．1μg/mlGBE100．46±0．10#0．320．01μg/mlGBE100．34±0．07-0．01control100．35±0．06-F38．64P0．0001

#P<0.01 vs control group(One-way ANOVA，LSD-t test)

圖11不同濃度銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活的影響

檢驗細(xì)胞存活的方法很多，如同位素釋放法、乳酸脫氫酶釋放改良法、三磷酸腺苷發(fā)光法等。MTT比色法由于簡單經(jīng)濟、快速、無放射性污染，其檢測結(jié)果與同位素?fù)饺敕ㄓ辛己玫囊恢滦訹11]，故可有效地應(yīng)用于視神經(jīng)保護(hù)藥物篩選等研究。

MTT比色分析法是由Mosmann[12]在1983年首創(chuàng)，MTT法測定細(xì)胞活性的機制[13]：MTT(噻唑蘭)是一種淡黃色可溶性化合物，是顯示線粒體中的琥珀酸脫氫酶的試劑，MTT能被活的細(xì)胞吸收，通過組織化學(xué)反應(yīng)可產(chǎn)生不溶性的針狀藍(lán)色結(jié)晶甲瓚沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍[14]，而形成甲瓚的量與細(xì)胞存活數(shù)量成正比[15]，由于死亡的細(xì)胞并不著色，也不生成結(jié)晶，故判斷細(xì)胞活性的指標(biāo)是藍(lán)色產(chǎn)物的多少。細(xì)胞存活且生長活躍，藍(lán)色產(chǎn)物就多。在定量細(xì)胞活性上有應(yīng)用價值。

我們首先應(yīng)用MTT方法，篩選了銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的有效濃度，結(jié)果顯示：1000μg/ml GBE、500μg/ml GBE、100μg/ml GBE、10μg/ml GBE、1μg/ml GBE、0.1μg/ml GBE和50ng/mlBDNF各組與空白對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各濃度的銀杏葉提取物均有不同程度的保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的作用，且隨濃度的增加保護(hù)作用加強。這樣就為我們在細(xì)胞離子通道水平研究其保護(hù)作用提供了依據(jù)。

我們在實驗中體會到用MTT法檢測銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，有以下優(yōu)點：①快速、靈敏、操作簡單；②低成本、人為誤差較小；③重復(fù)性好、實驗條件易控制；④可批量實驗；⑤沒有放射性污染。

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