王　杰　李家明　張恩立　張　暉

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院公共基礎(chǔ)學(xué)院　安徽蚌埠　233030；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院　安徽合肥　230031）

腫瘤是目前全球所面臨的最棘手的公共衛(wèi)生問題之一，它對(duì)人類健康具有較嚴(yán)重的危害。近年來，隨著人口老齡化的加快和環(huán)境污染的加重，我國(guó)腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1,2]。而傳統(tǒng)細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也具有較強(qiáng)的抑制作用，因此開發(fā)選擇性高、療效佳的靶向抗腫瘤藥成為了國(guó)際研究的熱點(diǎn)[3,4]。

美洛昔康、吡羅昔康(圖1)是臨床中常用的一類具有苯并噻嗪環(huán)結(jié)構(gòu)的非甾體抗炎藥，具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗血栓、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等藥理活性[5,6]。辛兵[7]等通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，美洛昔康對(duì)卵巢癌細(xì)胞株(OVCAR-3、HTOA) 的抑制作用明顯優(yōu)于順鉑，且可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Thimmaraju[8]等研究表明，美洛昔康/泊洛沙姆407凝膠制劑對(duì)HL-60細(xì)胞株具有顯著的抑制作用，GI50<10μg/ml。本課題組對(duì)美洛昔康等苯并噻嗪類化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行剖析發(fā)現(xiàn)，該類化合物分子中的羥基和酰胺羰基可通過氫鍵形成一個(gè)穩(wěn)定六員環(huán)，該構(gòu)型和EGFR受體抑制劑吉非替尼的母核結(jié)構(gòu)相似（圖2），相關(guān)工作見文獻(xiàn)[9]。對(duì)本課題組前期研究總結(jié)時(shí)發(fā)現(xiàn)，含有-CF3基團(tuán)的苯并噻嗪衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的抑制活性優(yōu)于陽性對(duì)照組藥gefitinib。

圖1　美洛昔康、吡羅昔康的結(jié)構(gòu)

圖2　吉非替尼和昔康類化合物的結(jié)構(gòu)

本文依據(jù)生物電子等排原理和骨架躍遷原理，設(shè)計(jì)并合成了5個(gè)含-CF3基團(tuán)和1個(gè)含噻唑基團(tuán)的昔康衍生物，路線如Scheme，所合成的6個(gè)化合物的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，部分化合物對(duì)A549、A431具有較好的抑制活性。

一、實(shí)驗(yàn)部分

（一）儀器與試劑。LCQADVANTAGE MAX液質(zhì)連用質(zhì)譜儀 (FINNIGA公司)；Bruker 300 MHz超導(dǎo)核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；FA2004B電子天平(上海平軒科學(xué)儀器有限公司)；CO2培養(yǎng)箱（3111，美國(guó)SHELLAB公司)；倒置光學(xué)顯微鏡（TS100-FDH1，NILON 公司）；酶標(biāo)儀（SpectramaxM2e，Molecular Devices公司）。

3-氯甲基吡啶鹽酸鹽、氯乙酸乙酯、4-甲基氯化芐、糖精鈉、3-三氟甲基苯胺、2-氨基-5-甲基噻唑購自上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；4-甲氧基氯化芐、4-氯芐氯、乙醇鈉由本實(shí)驗(yàn)室自制；吉非替尼、美洛昔康由合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司提供；乙醇、二甲苯、DMF等常規(guī)試劑均購自合肥寶添科貿(mào)有限公司。

（二）化合物的合成。

1.3-氧代-1,2-苯并異噻唑-2-乙酸乙酯1,1-二氧化物（2）的合成。向一250mL三口燒瓶中加入30g糖精鈉（0.15mol）、18g氯乙酸乙酯（0.15mol）和 80mLDMF，磁力攪拌下，緩慢升溫至120℃反應(yīng)3h，經(jīng)TLC[V（石油醚）:V（乙酸乙酯）=1:1為展開劑]檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，水浴冷卻至25℃，攪拌下一次性加入250mL水，立即析出白色固體，于冰浴下靜止1h，抽濾，濾餅用冷水（50mL×3）洗滌，用80%乙醇重結(jié)晶，干燥，得白色固體化合物（35.3g），收率 87.5%，m.p.103～105℃。（文獻(xiàn)[10]m.p.106～108℃）。

2.4-羥基-2H-1,2-苯并噻嗪-3-羧酸乙酯1,1-二氧化物(3)的合成。向一裝有機(jī)械攪拌和溫度計(jì)的250mL三口燒瓶中加入60mL無水乙醇和2.6g被切成小塊狀的金屬鈉(0.11mol)，攪拌至鈉塊完全溶解后，將溫度升高至90℃，一次性快速加入10g自制干燥固體化合物2，攪拌0.5h后，反應(yīng)溫度調(diào)至60℃，繼續(xù)攪拌2h，TLC[V（石油醚）:V（乙酸乙酯）=2:1為展開劑]檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，將溫度降至5～10℃，機(jī)械攪拌下，一次性加入碎冰（72g）和濃鹽酸（28mL）混合液，析出白色固體，撤去攪拌將三口瓶放置冰鹽浴下1h，抽濾，濾餅用冷水洗滌（30mL×3），干燥得白色化合物 3（5.5g），收率為 55.0%，m.p.167～169℃(文獻(xiàn)[11]:m.p.169～170℃)。

3.4-羥基-2-（4-甲氧基芐基）-2H-1,2-苯并噻嗪-3-羧酸甲酯-1,1-二氧化物(4a）的合成。向一150mL三口燒瓶中加入5g化合物3（0.019mol）、30mLDMF及13g碳酸鉀（0.095mol），冰浴條件下磁力攪拌反應(yīng)0.5h后，分2批加入3.2 g4- 甲氧基氯化芐（0.020mol），常溫繼續(xù)反應(yīng) 2h，TLC[V（石油醚）:V（乙酸乙酯）=3:1為展開劑]檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，向?yàn)V液中加入50mL水，用乙酸乙酯（40mL×3）萃取，合并乙酸乙酯層，有機(jī)層用水（50mL×3）洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得淡黃色油狀物粗品3.9g，收率為52.7%，直接投下一步。

4.4-羥基-2-（4-甲氧基芐基）-N-（3-三氟甲基苯基）-2H-1,2-苯并噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物（5a）的合成。向一100 mL的三口燒瓶中加入3 g化合物4a（0.0077 mol）、1.49 g間三氟甲基苯胺（0.0093 mol）和 30 mL二甲苯，升溫至145℃，回流攪拌24 h。TLC[V（石油醚）：V（乙酸乙酯）1:1為展開劑]監(jiān)測(cè)反應(yīng)基本完全。冰鹽浴冷卻，析出固體，抽濾，丙酮重結(jié)晶，干燥，得白色固體 5a（1.5 g），產(chǎn)率：37.4%；m.p.246.7～248.2℃;1H-NMR （400 MHz,DMSO-d6）δ:13.80（s,1H,NH）,10.55（s,1H,OH）,8.18（s,1H,ArH）,8.10（d,J=8.0 Hz,1H,ArH）,7.74（t,J=7.6 Hz,2H,ArH）,7.69-7.62（m,4H,ArH）,7.54（d,J=7.6 Hz,1H,ArH）,7.16（s,1H,ArH）,6.96（d,J=8.4 Hz,1H,ArH）,6.69（d,J=8.4 Hz,1H,ArH）,4.52（s,2H,CONH）,3.65（s,3H,OCH3）;13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）167.4,155.0,138.1,137.1,134.4,132.5,131.0,129.7,129.4,129.0,125.7,125.3,124.8,122.7,122.3,120.9,118.2,111.2,109.5,107.1,56.1,54.5;ESI-MS m/z:503.21（M+-H）。

類似方法合成化合物5b～5f。

5b：白色固體，產(chǎn)率：41.7%，m.p.221.9～223.4℃;1H-NMR（300 MHz,DMSO-d6）δ:13.74（s,1H,NH）,10.50（s,1H,OH),8.14（s,1H,ArH）,8.09（d,J=8.4 Hz,1H,ArH）,7.78～7.72（m,2H,ArH）,7.70～7.66（m,1H,ArH）,7.63（d,J=7.8 Hz,2H,ArH）,7.54（d,J=7.8 Hz,1H,ArH）,6.84（d,J=8.1 Hz,2H,ArH）,6.74（d,J=7.8 Hz,2H,ArH）,4.53（s,2H,CONH）,2.04（s,3H,ArCH3）;13C-NMR（75MHz,DMSO-d6）167.5,159.4,138.0,137.3,137.0,132.5,129.9,129.7,129.4,129.0,128.2,127.8,125.8,125.4,125.3,122.8,122.7,121.0,118.2,107.3,55.4,20.4;ESI-MSm/z:487.11（M+-H）。

5c：白色固體 ，產(chǎn)率：39.6%，m.p.238.1～240.5℃;1H-NMR （400MHz,DMSO-d6）δ:13.75（s,1H,NH）,10.48（s,1H,OH）,8.02（d,J=6.8 Hz,1H,ArH）,7.75（d,J=7.2 Hz,2H,ArH）,7.70（t,J=7.2Hz,1H,ArH）,7.63（t,J=7.6Hz,1H,ArH）,7.57（d,J=7.6Hz,1H,ArH）,7.46（t,J=9.2Hz,1H,ArH）,7.01-6.94 （m,5H,ArH）,4.58 （s,2H,CONH）;13C-NMR（75MHz,DMSO-d6）166.9,138.9,137.3,132.6,132.2,131.6,131.1,130.0,129.7,129.5,129.1,128.6,127.1,126.0,125.0,124.6,122.3,119.9,117.4,106.6,54.2;ESI-MS m/z:507.53（M+-H）。

5d：淡灰色固體，產(chǎn)率：34.2%，m.p.248.6～251.3℃;1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）δ:13.80（s,1H,NH）,10.65（s,1H,OH）,8.17（s,1H,ArH）,8.11（d,J=8.0 Hz,1H,ArH）,7.80（d,J=8.0 Hz,2H,ArH）,7.73-7.67（m,2H,ArH）,7.65-7.59（m,3H,ArH）,7.55（t,J=7.6 Hz,1H,ArH）,7.30（d,J=8.4 Hz,2H,ArH）,4.72 （s,2H,CONH）;13C-NMR（75MHz,DMSO-d6）167.2,159.7,146.8,138.7,138.1,136.9,132.7,132.6,131.4,129.7,129.3,125.9,125.4,125.2,123.4,122.9,122.7,122.1,121.0,118.2,118.1,107.2,54.9;ESI-MS m/z:518.17（M+-H）。

5e： 灰 色 固 體 ,產(chǎn) 率 ：35.1%,m.p.241.7～243.5℃ ;1H-NMR（300 MHz,DMSO-d6）δ:13.86（s,1H,NH）,12.05（s,1H,OH）,8.64（d,J=4.5 Hz,1H,PyH）,8.25（s,1H,PyH）,8.06（d,J=8.1 Hz,1H,PyH）,7.99～7.96（m,1H,PyH）,7.91～7.86（m,3H,ArH）,7.80～7.74（m,1H,ArH）,7.70（d,J=8.1 Hz,1H,ArH）,7.57（d,J=7.5 Hz,1H,ArH）,7.40～7.33（m,2H,ArH）,4.65（s,2H,CONH）;13C-NMR:（75MHz,DMSO-d6）δ:167.2,159.4,138.8,137.1,132.6,132.4,131.2,130.8,130.5,129.9,128.0,127.8,127.4,127.3,125.7,124.4,122.7,121.2,120.6,107.2,55.4;ESI-MSm/z:476.13（M++H）。

5f：淡黃色固體，產(chǎn)率：30.7%，m.p.227.5～228.9℃;1H-NMR（300MHz,DMSO-d6）δ:14.55（s,1H,NH）,7.72-7.62（m,4H,ArH）,7.32（s,1H,ThH）,6.72（d,J=8.1 Hz,2H,ArH）,6.67（d,J=8.1Hz,2H,ArH）,4.71（s,2H,CONH）,2.34（s,3H,ThCH3）,2.06 （s,3H,ArCH3）;13C-NMR（75MHz,DMSO-d6）168.4,157.4,136.9,136.7,131.9,131.2,130.4,129.6,129.4,128.9,128.7,127.9,127.5,125.7,125.6,123.7,121.7,110.4,52.8,20.5,11.8;ESI-MSm/z:440.21（M+-H）。

（三）體外抗腫瘤活性測(cè)試。該實(shí)驗(yàn)以吉非替尼為陽性對(duì)照，采用MTT法測(cè)試化合物5a～5f的體外抗腫瘤活性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、A431細(xì)胞以2×104個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，100μL/孔，每種細(xì)胞各種4塊板，培養(yǎng)24h，分別加入 0、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 及1024μmol/L的待測(cè)藥物和陽性對(duì)照及空白對(duì)照200μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后吸棄上清，加入0.5mg/mLMTT的培養(yǎng)液20μL/孔，繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入200μL/孔二甲基亞砜，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，將試劑對(duì)照調(diào)零，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以公式IR=（1-藥物組OD值/細(xì)胞對(duì)照組OD值）×100%計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，同時(shí)計(jì)算IC50值[12]。

二、結(jié)果與討論

（一）化合物的合成。糖精鈉和氯乙酸乙酯在高溫下經(jīng)親核取代反應(yīng)生成化合物2，以80%乙醇重結(jié)晶，產(chǎn)率及純度較高。化合物2在乙醇鈉作用下經(jīng)Gabriel-Colman反應(yīng)制得化合物3，在反應(yīng)過程中要隨時(shí)監(jiān)控反應(yīng)體系的狀態(tài)，當(dāng)反應(yīng)體系過于粘稠時(shí)加入少許無水乙醇，保證反應(yīng)體系為橙黃色漿狀物，且此步反應(yīng)要嚴(yán)格控制無水，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，一定要等溫度降至10℃以下，再一次性快速加入濃鹽酸和碎冰混合物，否則影響產(chǎn)率，甚至無固體生成。此步反應(yīng)溫度也是能否合成化合物3的關(guān)鍵，文獻(xiàn)報(bào)道，反應(yīng)溫度始終控制在60℃，但實(shí)際操作產(chǎn)率較低，后期依據(jù)其他相關(guān)文獻(xiàn)，先將溫度控制在90℃反應(yīng)0.5h，然后再調(diào)至60℃，收率明顯提高。原因可能為前期高溫給Gabriel-Colman反應(yīng)過程中的三元環(huán)過渡態(tài)提供了較高的能量，促使反應(yīng)快速進(jìn)行?；衔?與不同芐氯經(jīng)取代反應(yīng)制取4a～4d，4a～4d與不同取代氨經(jīng)酯的氨解反應(yīng)制得化合物5a～5f，其中5f的產(chǎn)率相對(duì)較低，可能由于噻唑氨的活性較苯胺活性低。

（二）體外抗腫瘤活性。6個(gè)目標(biāo)化合物的體外MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，從表中數(shù)據(jù)可知，6個(gè)化合物對(duì)A431、A549的抑制活性均明顯優(yōu)于美洛昔康，側(cè)鏈為CF3的化合物芐基取代為吸電子基化合物對(duì)A431、A549的抑制活性優(yōu)于芐基取代為給電子基化合物?；衔?b對(duì)A431的抑制活性與吉非替尼相當(dāng)，對(duì)A549的抑制活性優(yōu)于吉非替尼，化合物5a對(duì)A431、A549的抑制活與吉非替尼相當(dāng)。本課題組準(zhǔn)備下一步對(duì)側(cè)鏈為CF3的化合物芐基取代為給電子基化合物的活性和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)一步研究，并對(duì)該類化合物的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

表1　目標(biāo)化合物的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性

三、結(jié)論

依昔康類藥物為模型化合物，運(yùn)用生物電子等排原理和骨架躍遷原理，設(shè)計(jì)并合成了6個(gè)全新昔康衍生物，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS譜圖確證。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有化合物對(duì)A431、A549均具有一定的抑制活性，其中化合物5b對(duì)A549具有顯著的抑制活性，IC50值為15.56 μmol?L-1。

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