鄭偉偉，何建瑜，唐 益，魏余興，樊英萍，陳 健，劉雪珠

(1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.Department of Biology，University of Pisa，Pisa 56125，Italy；3.浙江海洋大學(xué)海洋生物博物館，浙江舟山 316022)

大型海洋動(dòng)物干制填充標(biāo)本是將海洋生物整體或部分組織作為樣品，經(jīng)過物理或化學(xué)手段防腐，使其能夠長久保存，為展示、教學(xué)、以及科學(xué)研究之用。然而因大型海洋動(dòng)物標(biāo)本都為生物有機(jī)體，多含有一定量的糖類、脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，盡管已做防腐處理，仍易受到霉菌的侵害，發(fā)生霉變[1-2]。生物標(biāo)本的霉變主要發(fā)生在其表面[3-4]，不同的霉菌可以產(chǎn)生無性孢子和有性孢子，其生長過程的代謝行為勢(shì)必對(duì)生物體造成霉腐等劣化行為[5-14]，會(huì)嚴(yán)重影響到生物標(biāo)本的觀賞和科研價(jià)值。目前，我國各海洋生物標(biāo)本館的干制填充標(biāo)本霉變現(xiàn)象非常普遍，但關(guān)于霉變的研究報(bào)道多數(shù)其中于經(jīng)濟(jì)作物[7-10，15]，有關(guān)大型海洋動(dòng)物標(biāo)本霉變與防治幾乎沒有。本實(shí)驗(yàn)旨在從霉變標(biāo)本上篩選霉變菌株并鑒定，測(cè)試幾種常見市售防霉劑對(duì)霉變菌株的抑制效果，為針對(duì)性地篩選有效的海洋生物標(biāo)本防霉劑提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 霉菌的分離純化

采樣時(shí)間為2017年梅雨季節(jié)間的6月15日，無菌操作于浙江海洋大學(xué)海洋生物博物館中的銀杏齒中喙鯨Mesoplodon ginkgodens的右側(cè)背鰭基底體側(cè)腹部、鯨鯊Rhincodon typus的右側(cè)第2鰓裂至第3鰓裂間及侏儒抹香鯨Kogia sima的尾柄左側(cè)皮膚表面采集霉變樣本 (采樣部位取決于該部位霉菌生長是否旺盛)，返回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行無菌分離培養(yǎng)[16]。將霉變樣品接種于已滅菌處理的馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)[17]，于28℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d，挑取單菌落并反復(fù)劃線純化菌株。純化后的菌種一部分用于鑒定和抑制實(shí)驗(yàn)，4℃保存；另一部分制成20%甘油菌懸浮液，-20℃保存。

1.2 菌株鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

利用載玻片觀察培養(yǎng)法，對(duì)不同生長階段的霉菌進(jìn)行高倍鏡鏡檢，觀察分生孢子結(jié)構(gòu)，包括分生孢子頭球、分生孢子梗和菌絲，并拍照記錄[16，18]。根據(jù)霉菌菌落特征及菌株的顯微形態(tài)初步排除部分重復(fù)菌株。

1.2.2 ITS基因鑒定

用真菌DNA提取試劑盒(Fungi Genomic DNA Extraction Kit，Solarbio)提取純化培養(yǎng)菌株的DNA，采用真菌特異性引物 (ITS1：5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇和 ITS4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[19-21]，50 μL 反應(yīng)體系為：10×buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，Primer ITS1 1 μL，Primer ITS4 1 μL，ddH2O 35.5 μL，Taq 酶(TaKaRa)0.5 μL，25 mM MgCl25 μL，模板 DNA 1 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性 20 s，50～60 ℃退火 20 s，72 ℃ 延伸 20～50 s，循環(huán) 35次；最后 72 ℃延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物純化后送上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。經(jīng)GenBank中Blastn序列比對(duì)后，用MEGA 5.1中的Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)樹每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以Bootstrap方法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1 000次[22-24]。

1.3 防霉劑稀釋處理

試驗(yàn)選擇的4種常用的克霉劑，多菌靈、克霉唑、苯甲酸鈉、尼泊金乙酯皆從市場購置。將上述4種不同防霉劑制成安全范圍內(nèi)(安全濃度范圍指各防霉劑用量低于小白鼠或狗的口服LD50值)不同濃度的系列溶液，即實(shí)驗(yàn)溶液的最大濃度均低于文獻(xiàn)報(bào)道的安全濃度[25]。其中多菌靈的最大實(shí)驗(yàn)濃度為700 mg/L(濃度梯度首次設(shè)置為200～700 mg/L，間隔為100 mg/L，后補(bǔ)充550 mg/L及650 mg/L)，克霉唑的最大實(shí)驗(yàn)濃度為 15 000 mg/L(濃度梯度分別為 2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 和 15 000 mg/L)，苯甲酸鈉為 800 mg/L(濃度梯度為200～800 mg/L，間隔為100 mg/L)、尼泊金乙酯為15 000 mg/L(濃度梯度設(shè)置同克霉唑)。

1.4 防霉劑抑制霉變菌株試驗(yàn)

將100 μL濃度已知的霉菌孢子懸浮液(1×106±2×105spores/mL)，加入到PDA平板中，涂布均勻，制成菌板。取上述各溶液2.5 μL置于圓形濾紙片(Φ=6 mm)上，制得不同含量的防霉劑濾紙片，濾紙片平貼于上述含菌板中，每種防霉劑每個(gè)濃度3次平行試驗(yàn)，溶劑為空白對(duì)照。將貼好濾紙片的平板28℃恒溫倒置培養(yǎng)。每天觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑[26]。選取抑制效果最優(yōu)的防霉劑進(jìn)行最低抑制濃度的測(cè)定。

1.5 液體培養(yǎng)法測(cè)多菌靈最低抑制濃度

將多菌靈溶液測(cè)試濃度配制成0.2～1.6 mg/L共7個(gè)梯度，每株菌每個(gè)濃度平行3組。每組的配比為：4 mL查氏液體培養(yǎng)基+0.5 mL孢子懸浮液+0.5 mL多菌靈溶液。設(shè)空白對(duì)照為純培養(yǎng)基與加孢子懸浮液的培養(yǎng)基。最后將上述試驗(yàn)組與對(duì)照組放入搖床140 r/min，28℃恒溫培養(yǎng)，觀察有無霉菌生成[27]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0進(jìn)行單因子顯著性差異分析(One-Way ANOVA)和t檢驗(yàn)[28]，以R軟件ggplot程序包做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉變菌株的篩選與鑒定

經(jīng)分離和反復(fù)劃線純化，獲得8株菌株，再經(jīng)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察，去除酵母菌，最終得到6株菌株，分別編號(hào)為 D1、D2、D3、D4、D5 和 D6。

10倍目鏡下用高40倍物鏡觀察霉菌形態(tài)，菌株D1、D2、D3、D5均具有曲霉屬的顯著特征，分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，呈球形；菌株D4、D6具有青霉屬的顯著特征，分枝成帚狀的分生孢子從菌絲體伸向空中。

2.2 霉菌ITS鑒定結(jié)果

利用Blastn從GenBank獲取該6株霉菌同源性達(dá)99%的相似菌株，對(duì)相似菌株的分離源進(jìn)行分析。經(jīng)MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 1所示，D1、D2、D3和D5與曲霉菌屬關(guān)系較近，D4和D6與青霉菌屬親緣關(guān)系較近。結(jié)合顯微形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，6株霉變菌株的鑒定結(jié)果與基因登錄號(hào)分別為聚多曲霉 A.sydowii D1(MG799216)、日本曲霉 A.japonicas D2(MG799217)、棘孢曲霉 A.aculeatus D3(MG799218)、產(chǎn)黃青霉 Penicillium chrysogenum D4(MG799219)、黃曲霉 A.flavus D5(MG799220)和中文名不詳?shù)那嗝咕鶳.hispanicum D6(MG799221)。其中D1菌株來自銀杏齒中喙鯨的右側(cè)背鰭基底體側(cè)腹部，D2和D3菌株樣品取自鯨鯊右側(cè)第2鰓裂至第3鰓裂間，菌株D4和D5來自鯨鯊眼后部頭上皮膚，D6菌株取自侏儒抹香鯨的尾柄左側(cè)皮膚。推測(cè)引起不同動(dòng)物標(biāo)本的優(yōu)勢(shì)菌種存在一定的差異。

圖1 基于真菌ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic dendrogram of 6 mildews based on the ITS gene

2.3 4種防霉劑對(duì)霉變菌株的抑制作用

4種防霉劑對(duì)6株霉變菌株的抑制效果及最佳抑制濃度見表1。結(jié)果顯示苯甲酸鈉 (最高試驗(yàn)濃度8 000 mg/L)和尼泊金乙酯(最高試驗(yàn)濃度15 000 mg/L)在安全范圍內(nèi)所有濃度對(duì)6株霉菌均無抑制作用；克霉唑?qū)?種霉菌的抑制作用程度相近。多菌靈對(duì)青霉菌P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)曲霉菌A.sydowii D1、A.japonicas D2、A.aculeatus D3抑制效果相對(duì)較弱，對(duì)黃曲霉A.flavus D5的抑制作用最弱。

表1 4種防霉劑對(duì)6株霉變菌株的最佳抑制濃度及抑制效果Tab.1 Optimum inhibitory concentration and result of 4 antifungal agents effecting on each mildew

2.4 多菌靈對(duì)6株霉菌的抑制效果

多菌靈對(duì)6株霉菌菌株的抑制作用如圖2所示，在所有濃度中最佳抑制效果如圖3所示。結(jié)果顯示，多菌靈對(duì)青霉屬的菌株抑制效果優(yōu)于曲霉屬的菌株(P＜0.05)，所有濃度下均能較強(qiáng)抑制P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6(抑菌圈直徑＞20 mm)，最佳抑制濃度均為550 mg/L，抑菌圈直徑分別為45.5±1.7 mm和41.5±1.0 mm，抑制作用無顯著差異(P＞0.05)。多菌靈對(duì)曲霉屬菌株的抑制作用則存在較大的差異：在相對(duì)低濃度(200～500 mg/L)時(shí)，多菌靈對(duì) A.aculeatus D3的抑制作用一直處于最高，其次為A.japonicas D2，對(duì)A.flavus D5有微弱的作用，而對(duì)A.sydowii D1無抑制作用。從550 mg/L開始，多菌靈對(duì)菌株A.sydowii D1產(chǎn)生抑制作用，一直維持到最高濃度，抑制水平與A.japonicas D2和A.aculeatus D3相近，且三者的抑菌圈直徑顯著高于A.flavus D5 (P＜0.05)。雖然所有濃度多菌靈都顯示對(duì)A.flavus D5的抑制作用，但作用一直較弱，抑菌圈直徑均小于12 mm。

圖2 多菌靈對(duì)6株霉菌的抑制效果Fig.2 The inhibition effect of carbendazim on 6 strains of mildew

圖3 多菌靈最佳抑制濃度下6株霉菌的抑菌圈Fig.3 The inhibitive effect of 6 strains under the optimum inhibitory concentration of carbendazim

2.5 多菌靈對(duì)6株致霉菌的最低抑制濃度

多菌靈對(duì)A.sydowii D1、A.japonicas D2、A.aculeatus D3、P.hispanicum D6的最低抑制濃度(minimum inhibition concentration，MIC)均為0.2～0.4 mg/L，對(duì)D4產(chǎn)黃青霉 P.chrysogenum 的MIC值略高，為 0.4～0.6 mg/L(表2)。方貽文在研究臍橙留樹貯藏技術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)多菌靈對(duì)黑曲霉、黃曲霉、擬青霉、木霉的MIC分別為1.0、1.5、1.5和0.6 mg/L[7]，均比本次實(shí)驗(yàn)從海洋動(dòng)物標(biāo)本中所篩選的上述5株霉菌的最低抑制濃度高。然而多菌靈對(duì)鑒定為黃曲霉的A.flavus D5菌株的抑制效果較弱，其MIC相對(duì)較高為1.6～2.0 mg/L，與上述文獻(xiàn)數(shù)值較為一致。

表2 多菌靈對(duì)6株霉菌的最低抑制濃度(MIC)Tab.2 The minimum inhibitory concentration(MIC)of carbendazim inhibiting the growth of 6 molds

2.6 克霉唑?qū)?株霉菌的抑制效果

克霉唑?qū)?株霉菌菌株的抑制作用如圖4所示，在所有濃度中最佳抑制效果如圖5所示。結(jié)果顯示，與多菌靈比較，克霉唑?qū)γ棺兙甑囊种谱饔脹]有明顯的種屬差異性，但在同一濃度下對(duì)不同菌株的抑制效果也略顯不同。所有菌株在低濃度時(shí)(2 000 mg/L)就有被抑制現(xiàn)象，產(chǎn)生較明顯的抑菌圈，且此濃度下對(duì)曲霉菌屬的抑制效果略強(qiáng)(抑菌圈直徑＞30 mm)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在所有濃度下(2 000～15 000 mg/L)克霉唑?qū)η箤俚木鄱嗲?A.sydowii D1、日本曲霉A.japonicas D2和棘孢曲霉 A.aculeatus D3均有較強(qiáng)抑制效果，最強(qiáng)抑制濃度分別為15 000、4 000和4 000 mg/L(抑菌圈直徑分別為38.2±0.6 mm、34.3±2.1 mm和32.7±1.5 mm)。比較奇怪的是除了在濃度為2 000 mg/L時(shí)，克霉唑?qū)S曲霉A.flavus D5的抑制作用略勝于青霉菌P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6外，在其余濃度下抑制作用皆為最弱。對(duì)青霉菌屬的D4和D6菌株而言，克霉唑能產(chǎn)生較大的抑菌圈(抑菌圈直徑＞20 mm)，產(chǎn)生最大抑菌圈的濃度分別為8 000和6 000 mg/L。

圖4 克霉唑?qū)?株霉變菌株的抑制效果Fig.4 The inhibition effect of clonazole on six molds

圖5 克霉唑最佳抑制濃度下6株霉菌的抑菌圈Fig.5 The inhibitive effect on 6 strains under the optimum inhibitory concentration of clotrimazole

3 討論

國內(nèi)外對(duì)于防霉的研究多數(shù)集中于經(jīng)濟(jì)作物、木材及飼料等的儲(chǔ)存及霉菌病的防治上[29-34]，還未見有針對(duì)海洋動(dòng)物標(biāo)本霉變的防治研究。采用常規(guī)分離純化方法，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分析共獲得6株引起海洋動(dòng)物霉變的菌株，4株為曲霉菌，2株為青霉菌。聚多曲霉A.sydowii D1和日本曲霉A.japonicas D2在霉變微生物中較為少見[35-36]，棘孢曲霉A.aculeatus D3和青霉菌P.hispanicum D6未見有報(bào)道出現(xiàn)在其他材料的霉變樣品中。研究還發(fā)現(xiàn)6株菌來源于不同樣品源，引起海洋生物干制標(biāo)本霉變菌株具有一定的特異性，推測(cè)可能與標(biāo)本質(zhì)地有關(guān)。要全面了解引起海洋生物標(biāo)本霉變菌，下一步研究需要進(jìn)行更廣泛的取樣。

分析4種市售防霉劑對(duì)各霉變菌株的抑制效果，研究發(fā)現(xiàn)只有多菌靈和克霉唑?qū)Ρ緦?shí)驗(yàn)的標(biāo)本霉變菌株有抑制效果。多菌靈對(duì)青霉屬的P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6抑制效果最佳；對(duì)聚多曲霉A.sydowii D1、日本曲霉A.japonicas D2、棘孢曲霉A.aculeatus D3抑制相對(duì)弱一些，且聚多曲霉A.sydowii D1對(duì)多菌靈的濃度敏感性較強(qiáng)；對(duì)黃曲霉A.flavus D5的抑制作用更弱，這可能和多菌靈的抑菌機(jī)制有關(guān)(多菌靈可與紡錘絲的微管蛋白質(zhì)相結(jié)合從而對(duì)有絲分裂進(jìn)行干擾。但是紡錘絲微管蛋白質(zhì)的細(xì)微改變都可降低多菌靈與微管蛋白質(zhì)的結(jié)合力，因而易引起抗藥性[37]。)，同一濃度對(duì)不同菌株的抑制作用存在著顯著差異(P＜0.05)，顯示多菌靈在防霉效果上有一定的物種選擇性。相反，克霉唑?qū)η箤俚木暌种菩Ч詮?qiáng)于青霉屬的菌株，但差異不大，同一濃度對(duì)不同菌株的抑制作用差異也較小，顯示為較廣譜的抑制效果。在相同濃度下兩種防霉劑對(duì)常見腐霉菌黃曲霉的抑制作用都較弱，黃曲霉菌是否已經(jīng)對(duì)現(xiàn)有防霉劑產(chǎn)生一定的耐藥性值得進(jìn)一步研究。市售防霉劑對(duì)食品、木材等有作用的化學(xué)防霉劑不一定對(duì)海洋生物標(biāo)本防霉有效，不同的防霉劑對(duì)同一菌株的抑制效果不同，同種防霉劑對(duì)不同霉變菌株的抑制效果也不同，有必要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中更廣泛地篩選市售防霉劑。張明輝在研究抑制藍(lán)濕革霉菌生長時(shí)采用復(fù)配防霉劑的防霉性能明顯提高，復(fù)配濃度和各自的最低抑菌濃度都有顯著下降[26]。提示除了廣泛篩選防霉劑外，還可進(jìn)行混合配比研究，以期得到對(duì)海洋生物標(biāo)本霉變菌有更強(qiáng)抑制作用、安全性更好的混合防霉制劑。