肖敏，舒佳為，覃瑞，劉虹，楊光忠

(1.中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北　武漢　430074；2.大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧　大連　116600；3.中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北　武漢　430074；4.中南民族大學(xué) 民族藥學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，湖北　武漢　430074)

木瓜的正品皺皮木瓜Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai為薔薇科貼梗海棠的果實，植物資源豐富，其主要的化學(xué)成分包括鞣質(zhì)類、黃酮類、皂苷類、有機酸、三萜等結(jié)構(gòu)類型，具有抑菌、抗氧化、保肝和抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性，酚酸類為其主要的活性成分[1-3]。基于此，本文利用大孔樹脂對酚酸類分離純化工藝進行研究，富集總酚酸的含量達到50%以上，并對其抗氧化和抗糖尿病活性進行研究，旨在為后續(xù)開發(fā)該植物資源，創(chuàng)制新藥打下基礎(chǔ)[4-5]。

1　儀器與材料

1.1 儀器

可見分光光度計UV1800C(上海美譜達儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-200A(上海亞榮生化儀器廠)；電子分析天平CP224C(上海奧豪斯儀器有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵SHB-111A(上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備有限公司)；臺式恒溫振蕩器THZ-B(太倉市實驗設(shè)備廠)；蠕動泵驅(qū)動器BT100-2J(保定蘭格恒流泵有限公司)；Multiskan酶標儀(美國熱電Thermo公司)；真空冷凍干燥機(丹麥Labogene公司)；玻璃層析柱2×30 cm。

1.2 材料

樹脂D101、AB-8(上海摩速科學(xué)器材有限公司)；NKA-9、S-8、HPD750、D1400(鄭州華溢科技新材料股份有限公司)；超純水(自制)；福林酚、對照品沒食子酸、DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼)、ABTS[2-2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺]、α-葡萄糖苷酶、PNPG(對硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷)、阿卡波糖(上海源葉生物科技有限公司)；α-淀粉酶、starch azure(SIGMA)；甲醇、乙醇、乙酸、Na2CO3、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、K2S2O8、AR(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；DMSO(Sigma-aldrich VETEC試劑)。

皺皮木瓜產(chǎn)地湖北長陽，經(jīng)中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉虹博士鑒定為Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai。

2　方法與結(jié)果

2.1 大孔樹脂純化工藝

2.1.1 總酚酸含量的測定福林酚法[6-7]測定總酚酸含量，標準品沒食子酸及待測物全波長掃描見圖1。精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度。量取沒食子酸對照品溶液1、2、3、4、5 mL，分別置于100 mL容量瓶中，各加入甲醇定容至刻度，搖勻，分別取1 mL至比色管，加入5 mL體積分數(shù)為10%福林酚試劑，反應(yīng)10 min后加入5 mL質(zhì)量濃度為2%Na2CO3溶液搖勻，25 ℃條件下靜置1 h后在760 nm處測定各標準溶液的吸光度，以沒食子酸質(zhì)量濃度(X))對其吸光度(Y)作曲線，得回歸方程Y=0.013 2X-0.000 4，r=0.999 6，總酚含量測定的線性范圍為0～50 μg·mL-1。待測樣品按照此方法測定。

圖1　全波長掃描

2.1.2 上樣液的制備精確稱取一定量皺皮木瓜原藥材粉末，以體積分數(shù)60%乙醇溶液、1∶40料液比、90 ℃、回流提取5 h為條件，抽濾后棄藥渣得到提取液，濃縮至恒重，超純水溶解，冷凍后用真空冷凍干燥機干燥成粉末，備用。其中皺皮木瓜總酚酸浸膏得率為38.9%(浸膏得率=浸膏質(zhì)量/原藥材質(zhì)量×100%)，總酚酸含量為30.3%(總酚酸含量=總酚酸質(zhì)量/浸膏質(zhì)量×100%)。

2.1.3 樹脂的篩選將預(yù)處理的6種不同型號規(guī)格的大孔樹脂烘干備用。分別稱取上述各型號樹脂約2 g，置于150 mL錐形瓶，向其中加入25 mL一定濃度總酚酸溶液，封口膜封口，置于恒溫振蕩器中，25 ℃、120 r·min-1，振蕩24 h，達到吸附平衡后過濾，福林酚法測定濾液總酚酸濃度。將上述過濾的樹脂水洗后吸干水分，加入25 mL 60%的乙醇溶液，封口膜封口，置于恒溫振蕩器，25 ℃、120 r·min-1，振蕩24 h，充分解吸后過濾，福林酚法測定濾液總酚酸濃度，結(jié)果見表1?？梢?，D101大孔樹脂對皺皮木瓜總酚酸的吸附和解吸能力都很強，最終選用D101。

吸附量=(m0-m1)/G

(1)

吸附率=(m0-m1)/m0

(2)

解吸率=m2/(m0-m1)

(3)

注：m0：吸附前酚酸質(zhì)量(mg)；m1：吸附后酚酸質(zhì)量(mg)；m2：解吸的酚酸質(zhì)量(mg)；G：大孔樹脂質(zhì)量(g)。

表1　各大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸性能

2.1.4 動態(tài)上樣流速、濃度及體積考察取約5 g大孔樹脂裝柱，將濃度為1 mg·mL-1的總酚酸溶液分別以1、2、3、4、5 BV·h-1的流速進行樹脂柱的上樣，10 BV后停止上樣，測定流出液的酚酸含量。結(jié)果見圖2，可見隨著上樣流速的增加，吸附率逐漸下降，考慮到工藝成本和時間效率，確定最佳上樣流速為2 BV·h-1。

圖2　上樣流速對D101大孔樹脂吸附率的影響

取約5 g大孔樹脂裝柱，將上樣濃度設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的總酚酸溶液以最佳流速上樣(2 BV·h-1)，收集10 BV后，測定收集液的酚酸含量，結(jié)果見圖3，可見隨著上樣濃度的增加，吸附率呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢，說明以D101的特性，不是濃度越大越好，而是在某個區(qū)域有很好的吸附能力，最終確定為上樣濃度為1.0 mg·mL-1。

圖3　上樣濃度對D101大孔樹脂吸附率的影響

取約5 g樹脂裝柱，以最佳濃度及流速上樣40 BV，以1 BV為單位收集流出液，測定每個BV的酚酸濃度，結(jié)果見圖4，可見隨著收集液的逐漸流出，到第20個柱體積酚酸含量有明顯的滲漏，說明此時達到了D101的飽和吸附量，再上樣吸附效果會變差，超過載荷，最終確定上樣體積為20 BV，即樹脂的飽和吸附量為100 mg·g-1。

圖4　泄露曲線

2.1.5 水洗流速及體積考察上樣結(jié)束后，樹脂表面以及層析柱內(nèi)壁會附著一些水溶性多糖及皂苷等，此時需要用水將這些未被大孔樹脂吸附的物質(zhì)除去。

取約5 g樹脂裝柱，以濃度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上樣10 BV，不同的水洗流速洗脫，以1 BV為單位收集流出液，合并相同流速收集的洗脫液，測定酚酸濃度，見圖5。結(jié)果顯示，隨著洗脫流速增加，流出的酚酸量也隨之增加，最后確定為2 BV·h-1進行超純水洗脫。

圖5　除雜用水流速的選擇

取約5 g樹脂裝柱，以濃度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上樣20 BV，2 BV·h-1水洗流速洗脫，以1 BV為單位收集流出液，以酚酸濃度為檢測指標，測定每個BV的酚酸濃度，結(jié)果見圖6，發(fā)現(xiàn)直至第5 BV酚酸泄漏量明顯減少，確定進行超純水洗脫的體積為4 BV。

圖6　除雜用水量的選擇

2.1.6 乙醇洗脫濃度、流速及體積考察由皺皮木瓜原藥材提取工藝可見，60%的乙醇對總酚酸具有很好的溶解能力，待樹脂吸附樣品，超純水除雜后，使用乙醇溶液進行解吸。

取約5 g樹脂裝柱，以濃度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上樣10 BV，收集流出液1，用2 BV·h-1的流速的超純水洗脫4 BV，收集洗脫液2，將乙醇濃度設(shè)置為20%、40%、60%、80%為上樣洗脫濃度，流速為2 BV·h-1，結(jié)果見圖7?？梢姰斠掖紳舛葹?0%時洗出酚酸量最多，確定60%的乙醇進行洗脫。

圖7　不同濃度乙醇洗脫對D101大孔樹脂吸附的影響

取約5 g樹脂裝柱，以濃度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上樣10 BV，收集流出液1，用2 BV·h-1的流速的超純水洗脫4 BV，收集洗脫液2，用濃度為60%乙醇用不同流速上樣，測定酚酸濃度，結(jié)果見圖8，改變洗脫流速對開始酚酸流出濃度影響較小，然而隨著流速的增大，洗脫率降低，最后確定最佳的洗脫流速為4 BV·h-1。

圖8　洗脫劑的流速對D101大孔樹脂吸附的影響

取約5 g樹脂裝柱，以濃度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上樣20 BV，收集流出液1，用2 BV·h-1的流速的超純水洗脫4 BV，收集洗脫液2，用濃度為60%乙醇4 BV·h-1流速洗脫，測定每個BV的酚酸濃度，結(jié)果見圖9，隨著洗脫體積的增加，酚酸含量逐漸減少至無，確定洗脫劑的體積4 BV。

圖9　洗脫體積的考察

2.1.7 最佳純化工藝驗證取約5 g D101大孔樹脂，裝柱，濃度近似1.0 mg·mL-1的皺皮木瓜總酚酸溶液上樣，上樣流速2 BV·h-1，上樣量20 BV，收集流出液1，超純水除雜，洗脫流速2 BV·h-1，用量4 BV，收集流出液2，60%乙醇溶液解吸，洗脫流速4 BV·h-1，用量4 BV，收集流出液3，分別測定3次流出液的酚酸濃度，獲得流出液3的質(zhì)量。重復(fù)3次此實驗，獲得吸附率和洗脫率及純化后皺皮木瓜總酚酸的含量。

結(jié)果見表2，純化后總酚酸的含量由30.3%提高到71.1%，相比純化前提高了2.3倍。

表2　D101大孔樹脂純化皺皮木瓜總酚酸驗證試驗

注：浸膏的回收率指純化前后浸膏質(zhì)量比。

2.2 純化后待測樣品的抗氧化活性初步研究

2.2.1 DPPH自由基清除率測定DPPH(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)是穩(wěn)定的自由基，為清除自由基活性的檢測提供了一個理想而又簡單的模型。配制不同濃度的樣品溶液，加入濃度為0.025 mg·mL-1的DPPH乙醇溶液2 mL，加入等體積的樣品溶液，混勻，靜置在37 ℃恒溫箱20 min，于519 nm處測定溶液吸光度[5]。結(jié)果見圖10～12，沒食子酸IC50=(0.049±0.003)mg·mL-1，抗壞血酸IC50=(0.101±0.011)mg·mL-1，純化后總酚酸IC50=(0.038±0.006)mg·mL-1。總酚酸清除DPPH自由基能力強于沒食子酸和抗壞血酸。

圖10　純化后樣品對DPPH·清除率的影響

圖11　抗壞血酸對DPPH·清除率的影響

圖12　沒食子酸對DPPH·清除率的影響

2.2.2 ABTS+·自由基清除能力7.4 mmol·L-1的ABTS 0.2 mL與2.6 mmol·L-1的K2S2O80.2 mL混合均勻，在黑暗條件下，室溫靜置12～16 h，稀釋一定倍數(shù)，讓A734nm在0.7附近，作為ABTS+·工作液，取0.8 mL工作液與0.2 mL樣品溶液，振搖10 s以充分混合，靜置6 min后于734 nm處測定吸光度。結(jié)果見圖13～15，純化后的總酚酸IC50=(5.428±0.163)mg·L-1，沒食子酸IC50=(1.929±0.07)mg·L-1，抗壞血酸IC50=(9.741±0.064)mg·L-1?？偡铀崆宄鼳BTS的能力強于抗壞血酸，但小于沒食子酸。

圖13　純化后樣品對ABTS+·清除率的影響

圖14　抗壞血酸對ABTS+·清除率的影響

圖15　沒食子酸對ABTS+·清除率的影響

2.3 純化后待測樣品的抗糖尿病活性的初步研究[8]

2.3.1 ɑ-淀粉酶抑制活性測定ɑ-淀粉酶抑制劑是一種糖苷鍵水解酶抑制劑，臨床上用于防治葡萄糖耐量缺損引起的餐后高血糖及早期糖尿病、高血脂、肥胖等癥[8-9]。本實驗探究純化后樣品是否具有α-淀粉酶抑制劑的功能。

取100 μL Tris-HCl-CaCl2緩沖液至EP管，加100 μL 50% DMSO溶解的樣品溶液，加100 μL 6 μg·mL-1ɑ-淀粉酶溶液，37 ℃恒溫箱靜置，同時制備底物，100 mg溶解于10 mL Tris-HCl-CaCl2緩沖液，煮沸5 min后轉(zhuǎn)移至恒溫箱，37 ℃靜置5 min，向EP管中加入200 μL底物(將煮沸過程中損失的水分補足至刻度)，37 ℃靜置20 min后，加500 μL 50%乙酸停止反應(yīng)，3000 r·min-1，4 ℃離心5 min，取上清液200 μL至96孔板，酶標儀測定吸光度。

I%=1-(A樣品組-A樣品對照組)/(A空白組-A空白對照組)×100%

(4)

結(jié)果見圖16～17，阿卡波糖抑制α-淀粉酶活性的IC50值為(0.229±0.007)mg·mL-1，總酚酸的IC50值為(0.34±0.001)g·mL-1。其活性同陽性藥物阿卡波糖相當。

圖16　純化后樣品的ɑ-淀粉酶抑制活性曲線

圖17　阿卡波糖的ɑ-淀粉酶抑制活性曲線

2.3.2 ɑ-葡萄糖苷酶抑制活性測定α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究一直是抗糖尿病機制研究中很活躍的方面[10]。實驗探究純化后樣品是否具有ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑的功能。

取80 μL磷酸緩沖液于96孔板，加入4 U·mL-1酶液30 μL，15 μL DMSO溶解的樣品，37 ℃反應(yīng)5 min，加入3 mmol·L-1PNPG 30 μL于37 ℃靜置15 min后于405 nm處測定吸光度。

I%=1-(A樣品組-A樣品對照組)/A空白組×100%

(5)

結(jié)果見圖18～19，阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶的活性IC50值為(0.426±0.262)g·mL-1，總酚酸IC50值為(0.071±0.024)mg·mL-1，說明總酚酸具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖18　純化后樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲線

圖19　阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲線

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5、Prism 6.01、SPSS對數(shù)據(jù)進行圖表制作及分析。

3　討論

本實驗通過對皺皮木瓜原藥材進行粉碎，乙醇回流加熱提取，獲得初提物。測定總酚酸含量后，將初提物以水溶解，通過初提液上樣吸附→水洗除雜→乙醇洗脫的步驟，得到純化后的總酚酸，同初提物相比含量提高2.3倍，且工藝穩(wěn)定可靠。純化后的總酚酸具有很好的清除DPPH、ABTS+的能力，且與陽性對照藥物阿卡波糖相比，總酚酸具有一定的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性。從相關(guān)文獻的報道的氧化應(yīng)激與糖尿病及并發(fā)癥的關(guān)系可以推測，本課題經(jīng)過純化的總酚酸在抗糖尿病領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[11-12]。本課題的研究不僅為皺皮木瓜種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供了參考，同時也為后續(xù)提升皺皮木瓜產(chǎn)品附加值提供了理論基礎(chǔ)。

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