劉源，丁廣軍，陳慧慧

(商丘市第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部，河南　商丘　476100)

仙方活命片處方源于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十七冊(cè)[1]，由金銀花、防風(fēng)、赤芍等13味中藥材加工而成，臨床上主要用于火毒壅盛、癰疽瘡瘍、紅腫熱痛、膿成不潰等癥狀的治療。方中金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，性味甘寒，最善清熱解毒療瘡，故重用為君藥；配以赤芍、當(dāng)歸尾、乳香、沒藥、陳皮行氣活血通絡(luò)、消腫止痛，共為臣藥；佐以防風(fēng)、白芷通滯散結(jié)，浙貝母、天花粉清熱化痰，結(jié)皂角刺、穿山甲通行經(jīng)絡(luò)、透膿潰堅(jiān)；甘草清熱解毒、調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏清熱解毒、散瘀消腫、化膿生肌之功[2]。

仙方活命片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有理化鑒別項(xiàng)，在質(zhì)量控制中尚顯不足，也未檢索到對(duì)該制劑定量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道，方中君藥金銀花含有有機(jī)酸、黃酮、皂苷及鞣質(zhì)等化學(xué)成分，其中有機(jī)酸主要為綠原酸、異綠原酸和咖啡酸等，黃酮類主要為木犀草素、忍冬苷和木犀草苷等，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部以綠原酸、木犀草苷為其質(zhì)量控制的指標(biāo)；方中臣藥赤芍含有單萜類、酚類、黃酮類、鞣質(zhì)類等成分，其中單萜類主要為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部以芍藥苷為其質(zhì)量控制的指標(biāo)；方中佐藥防風(fēng)含有揮發(fā)油、色原酮類、有機(jī)酸、香豆素類等成分，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷為其質(zhì)量控制的指標(biāo)。本研究采用HPLC波長(zhǎng)切換法，對(duì)仙方活命片方中金銀花所含綠原酸、木犀草素、木犀草苷，赤芍所含芍藥苷，防風(fēng)所含升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷進(jìn)行同時(shí)測(cè)定研究，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于仙方活命片質(zhì)量控制分析，對(duì)進(jìn)一步提高仙方活命片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了數(shù)據(jù)支持。

1　儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型全自動(dòng)高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；BS224S型電子分析天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司)；ASS150型超聲波提取器(濟(jì)寧科特超聲電子有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥

仙方活命片(規(guī)格：每片重0.35 g)來源于廣東萬(wàn)年青制藥有限公司；綠原酸對(duì)照品、木犀草苷對(duì)照品、木犀草素對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、升麻素苷對(duì)照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110753-201716、111720-201609、111520-201605、110736-201640、111522-201712、111523-201610)；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2　方法

2.1 色譜條件

采用Agilent SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇(1∶1)，流動(dòng)相B：0.4%磷酸溶液，梯度洗脫[3-4](0～10 min，15.0%A；10～24 min，15.0%A→32.0%A；24～31 min，32.0%A→38.0%A；31～39 min，38.0%A→50.0%A；39～45 min，50.0%A→15.0%A)；0～16 min時(shí)在326 nm[5]波長(zhǎng)下檢測(cè)綠原酸，16～24 min在350 nm[5-7]波長(zhǎng)下檢測(cè)木犀草苷和木犀草素，24～31 min時(shí)在230 nm[6，8-9]波長(zhǎng)下檢測(cè)芍藥苷，31～45 min在254 nm[6，10-11]波長(zhǎng)下檢測(cè)升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取對(duì)照品綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷各適量，用甲醇分別制成單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(綠原酸2.164 g·L-1、木犀草苷0.572 g·L-1、木犀草素0.436 g·L-1、芍藥苷1.494 g·L-1、升麻素苷1.532 g·L-1、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.718 g·L-1)。再分別依次吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5.0、2.5、2.5、5.0、5.0、5.0 mL，置同一100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取仙方活命片，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲提取30 min，放冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得仙方活命片供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備按仙方活命片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方和生產(chǎn)工藝，分別制備缺金銀花陰性樣品、缺防風(fēng)陰性樣品和缺赤芍陰性樣品，按2.2.2所述的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取2.2.1、2.2.3項(xiàng)下的溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在與對(duì)照品綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液色譜圖中有相應(yīng)的色譜峰，而陰性樣品色譜圖中未顯示對(duì)應(yīng)的色譜峰，陰性無干擾，專屬性強(qiáng)，色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各10.0 mL，用甲醇定容至100 mL，作為線性關(guān)系工作溶液Ⅰ，再用甲醇分別稀釋2、4、8、16、20倍，依次制得線性關(guān)系工作溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，見表1。

注：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.金銀花陰性樣品溶液；D.赤芍陰性樣品溶液；E.防風(fēng)陰性樣品溶液；1.綠原酸；2.木犀草苷；3.木犀草素4.芍藥苷；5.升麻素苷；6.5-O-甲基維斯阿米醇苷。圖1　對(duì)照品、供試品、金銀花陰性樣品、赤芍陰性樣品和防風(fēng)陰性樣品HPLC圖

表1　線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.63%、0.99%、1.13%、0.87%、1.02%和0.90%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次仙方活命片樣品6份，按照2.2.2的方法制備供試品溶液，再按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，并計(jì)算所測(cè)組分含量的RSD，結(jié)果所測(cè)組分的RSD依次為1.04%、0.37%、1.44%、0.79%、1.26%和1.51%。

2.7 穩(wěn)定性考察

取同一仙方活命片供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、16 h，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰面積值，結(jié)果仙方活命片供試品溶液室溫下16 h內(nèi)穩(wěn)定，所測(cè)各成分峰面積的RSD分別為0.59%、1.17%、1.06%、0.74%、0.96%和1.01%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的仙方活命片6份，每份約0.5 g，研細(xì)，精密稱定，分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液(0.627 g·L-1)5.0 mL、木犀草苷對(duì)照品溶液(0.381 g·L-1)1.0 mL、木犀草素對(duì)照品溶液(0.306 g·L-1)1.0 mL、芍藥苷對(duì)照品溶液(0.689 g·L-1)3.0 mL、升麻素苷對(duì)照品溶液(0.937 g·L-1)2.0 mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶液(0.993 g·L-1)1.0 mL，甲醇適量，按照供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品溶液。再按照2.1項(xiàng)下色譜條件及上述檢測(cè)方法，計(jì)算這6個(gè)組分的回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2　綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的回收率(n=6)

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批仙方活命片，按照2.2.2的方法制備供試品溶液，再按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量，結(jié)果見表3。

表3　含量測(cè)定結(jié)果(n=3)　mg·g-1

3　討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取所測(cè)各成分綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果綠原酸在326 nm處有最大吸收，木犀草苷和木犀草素在350 nm處有最大吸收，芍藥苷在230 nm處有最大吸收，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷在254 nm處有最大吸收。同時(shí)參考《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》2015年版一部金銀花、赤芍和防風(fēng)項(xiàng)下各成分的檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)合液相色譜圖，最終確定采用波長(zhǎng)切換法，0～16 min時(shí)在326 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)綠原酸，16～24 min在350 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)木犀草苷和木犀草素，24～31 min時(shí)在230 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)芍藥苷，31～45 min在254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷。

3.2 樣品制備方法的優(yōu)化

在選擇樣品溶液制備方法時(shí)，本文分別對(duì)提取方法：超聲提取、加熱回流提??；提取溶劑：甲醇、70%甲醇、50%甲醇、水；提取時(shí)間：30、60、90 min進(jìn)行了對(duì)比考察，以所測(cè)各成分綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的提取率和操作的便捷性為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的樣品制備方法為甲醇超聲提取30 min。

4　總結(jié)

本研究建立了HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定仙方活命片中綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芍藥苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的方法。該方法溶液制備簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好；所建立的方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，對(duì)進(jìn)一步提高仙方活命片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了數(shù)據(jù)支持，確保了仙方活命片的產(chǎn)品質(zhì)量和療效的一致性。

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