范修德，李娜，王西強(qiáng)，孫文剛，李倩，李漢超，王小云，賈皚

1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科，陜西 西安　710061

2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，陜西 西安　710061

3 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安　710061

4 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，陜西 西安　710061

5 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安　710061

肝細(xì)胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，有較高的發(fā)病率和死亡率，由于起病隱匿、病情發(fā)展迅速、較高的手術(shù)復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率等特點(diǎn)，臨床治療效果并不理想[1-2]。但是隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)的分子和細(xì)胞機(jī)制逐漸被認(rèn)識，生長因子及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已引起人們的極大關(guān)注，阻斷生長因子與其受體的相互作用可能在腫瘤的治療方面取得一定療效[3-4]。

血小板衍生生長因子 (Platelet-derived growth factor PDGF) 是 30多年前從人的血小板中分離出來的肽類生長因子，主要包括4種不同的多肽鏈：PDGF-A、B、C、D[5]。四種 PDGF多肽鏈通過二硫鍵的連接形成同型或異型二聚體，與血小板衍生生長因子受體 (Platelet-derived growth factor receptor PDGFR) 結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[6]。Doolittle等發(fā)現(xiàn)PDGF-B鏈基因與猴肉瘤病毒的癌基因v-sis有92%的同源性，PDGF-B與p28V-sis結(jié)構(gòu)的相似性表明，PDGF-B可能通過與膜上的受體結(jié)合，激活相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變[7]。在 5種不同的二聚體亞型PDGF-AA、PDGFAB、PDGF-BB、PDGF-CC 和PDGF-DD中，PDGF-BB是肝間質(zhì)細(xì)胞分泌的最主要的二聚體結(jié)構(gòu)，是唯一能與3種PDGF受體PDGFR-αα、PDGFR-αβ 及 PDGFR-ββ 均可結(jié)合的分子，也是目前與配體特異性結(jié)合位點(diǎn)研究最為清楚的分子[8]。正常肝臟僅表達(dá)少量的PDGF-B，但是在肝纖維化發(fā)生時PDGF-B的表達(dá)水平明顯提高，研究發(fā)現(xiàn)PDGF-B轉(zhuǎn)基因小鼠在6個月內(nèi)可以自發(fā)性地發(fā)生肝纖維化，而且PDGF-B的轉(zhuǎn)基因小鼠在二乙基亞硝胺 (Diethylnitrosamine，DEN) 誘導(dǎo)下，較非轉(zhuǎn)基因小鼠更早發(fā)生HCC，而且腫瘤進(jìn)展更快[9]。這些研究均提示PDGF-B與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，阻斷PDGF-B可能在HCC的治療方面取得一定療效。

因此本課題組將 hPDGF-B分子中與其生物學(xué)活性密切相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域插入到融合表達(dá)載體pET28-Trx中，構(gòu)建符合讀框的融合基因，將表達(dá)并純化的重組蛋白作為免疫原，主動免疫小鼠，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對hPDGF-B的特異性抗體，觀察其對人 HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，為PDGF-B疫苗的構(gòu)建及 HCC治療探索新的可行途徑。

1　材料與方法

1.1　菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動物

E. coliBL21(DE3)、pGEM-T載體、pET-28a(+)質(zhì)粒、pET-28a-Trx質(zhì)粒、人肝癌細(xì)胞系 HepG2均為本實(shí)驗(yàn)室保存；雄性昆明小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。

1.2　主要試劑

限制性內(nèi)切酶 (PstⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ和NdeⅠ)、T4 DNA連接酶、PCR引物、質(zhì)粒DNA試劑盒、膠回收試劑盒均購自 TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、DMSO、CCK8、胰蛋白酶購自Sigma公司；人重組細(xì)胞因子 PDGF-BB購自 R&D公司；pET28-PDGF-B重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并表達(dá)；His-tag抗體購自Abcam公司；HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自EarthOx公司。

1.3　引物設(shè)計(jì)

利用Primer5軟件設(shè)計(jì)hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167編碼序列引物，引物序列見表1。引物由TaKaRa公司合成。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s) 表示；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)法；采用單因素方差分析 (One Way ANOVA) 對多組樣本均數(shù)進(jìn)行比較。

1.5　hPDGF-B免疫原的制備

1.5.1　hPDGF-B抗原表位的預(yù)測

通過閱讀文獻(xiàn)和利用 B細(xì)胞表位預(yù)測軟件(http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/predict.htmL在線預(yù)測)，針對hPDGF-B與PDGFR作用的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了兩段16個氨基酸的短肽，即VFEISRRLIDRTNANF(16AA，103位到118位)和QVRKIEIVRKKPIFKK(16AA，152位到167位)，標(biāo)記為hPDGF-BΔ103-118和 hPDGF-BΔ152-167。

1.5.2　hPDGF-BΔ103-118和 hPDGF-BΔ152-167編碼序列的克隆

采用PCR技術(shù)以正常人的基因組cDNA為模板分別擴(kuò)增hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167編碼序列，DNA引物序列見表1。其中 hPDGF-BΔ103-118 1F和 hPDGF-BΔ152-167 1F 的 5′端分別引入PstⅠ酶切位點(diǎn)，hPDGF-BΔ103-118 1R和hPDGF-BΔ152-167 1R的3′端分別引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度均為65 bp。

表1　hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167編碼序列的引物核苷酸序列表Table 1　Primers used for expanding hPDGF-BΔ103-118 and hPDGF-BΔ152-167

1.5.3　hPDGF-BΔ103-118和 hPDGF-BΔ152-167原核表達(dá)載體的構(gòu)建

上述擴(kuò)增產(chǎn)物即特異 hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167基因片段經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，與pGEM-T載體連接，經(jīng)克隆篩選、PCR擴(kuò)增及基因測序鑒定 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司)。挑選陽性克隆，pGEM-T/hPDGF-BΔ103-118和pGEM-T/hPDGF-BΔ152-167以PstⅠ和BamHⅠ雙酶切，切膠純化回收后，與同樣處理的pET28-Trx表達(dá)載體在T4 DNA連接酶的作用下，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α擴(kuò)增，NdeⅠ+XhoⅠ雙酶切消化4 h，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和基因測序，檢測兩種重組質(zhì)粒的正確性。

1.5.4　重組蛋白的原核表達(dá)及純化

挑取pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118和pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167陽性E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌克隆，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS-PAGE鑒定，觀察有無目的條帶；大量誘導(dǎo)表達(dá)的 pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白和pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白分別通過Ni-NTA純化，純化后蛋白分別簡寫為6×his TrxhPDGF-BΔ103-118重組蛋白和6×his Trx-hPDGFBΔ152-167重組蛋白。

1.6　hPDGF-B抗體的制備及純化

1.6.1　動物免疫

將4周齡的昆明種雄性小鼠15只，隨機(jī)分成6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白免疫組、6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白免疫組及對照組各5只；將透析好的兩種hPDGF-B重組蛋白分別與弗氏完全佐劑按1∶1比例混合，充分混勻至完全乳化，腹腔注射相應(yīng)蛋白混合物0.2 mL，對照組注射 PBS溶液 0.2 mL；2周后，將兩種hPDGF-B重組蛋白分別與弗氏不完全佐劑按 1∶1比例混合，完全乳化后每只小鼠注射0.2 mL，對照組注射PBS溶液0.2 mL，每2周免疫一次；以后每隔1周通過斷尾靜脈采血的方法，以ELISA法測定hPDGF-B抗體滴度。

1.6.2　ELISA方法檢測小鼠血清抗體效價

原核表達(dá)的 PDGF-B重組蛋白定量后按20 ng/孔包被96孔酶標(biāo)板，封閉后將上述鼠尾血清用10%的牛血清/PBST稀釋液按一定的比例稀釋后，第一孔稀釋比為1∶200，依次倍比稀釋，最后一孔為陰性對照，以HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗 (1∶5 000) 進(jìn)行檢測，孵育后各孔依次加入底物A液和顯色B液各1滴，5 min向各反應(yīng)孔中加入終止C液1滴，觀察各孔顏色并記錄抗體滴度。

1.6.3　hPDGF-B多克隆抗體腹水的制備和純化

注射小鼠H22肝癌細(xì)胞前，6×his Trx-hPDGFBΔ103-118重組蛋白免疫組及 6×his Trx-hPDGFBΔ152-167重組蛋白免疫組的抗體滴度需達(dá)1∶8 000以上；用生理鹽水稀釋H22細(xì)胞濃度為1×107個/mL；將H22細(xì)胞懸液按0.5 mL/只的劑量注入免疫過的小鼠腹腔；注入H22細(xì)胞后7 d左右，小鼠體重逐漸停止增加，腹腔明顯膨隆，行動遲緩，皮毛無光澤，對照組小鼠精神及一般狀態(tài)均正常。取小鼠眼血后將小鼠處死抽取腹水，獲得PDGF-B多抗血清及多抗腹水，間接 ELISA檢測小鼠抗體滴度，而后用雙層濾紙過濾腹水；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清，精確定量腹水體積；采用辛酸硫酸銨法純化腹水抗體，取少量純化后的抗體適當(dāng)稀釋后，ELISA方法檢測純化腹水抗體效價 (方法同前)。

1.6.4　Western blotting法驗(yàn)證純化腹水抗體與PDGF-B的結(jié)合能力

收集的純化腹水經(jīng)過ELISA檢測含有高滴度的抗體，還需驗(yàn)證其與PDGF-B的結(jié)合能力，上樣蛋白選擇pET28-PDGF-B重組蛋白，通過制樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，用10 %的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗 Anti-hPDGF-BΔ103-118純化腹水抗體(1∶500)，Anti-hPDGF-BΔ152-167純化腹水抗體( 1∶500) 及 His-tag 抗體 (1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，分別加入二抗山羊抗小鼠IgG (1∶10 000) 于37 ℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，采用超靈敏多功能成像儀 (美國GE Amersham Imager 600；型號AI600) 采集蛋白條帶圖像。

1.7　hPDGF-B抗體對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

1.7.1　PDGF-BB對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，以每孔1×103個細(xì)胞接種于 96孔板，每孔加 150 μL，周圍孔則加入PBS，置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)分組：①無血清DMEM組；②1 ng/mL PDGF-BB組；③ 2 ng/mL PDGF-BB組；④4 ng/mL PDGF-BB組；⑤ 8 ng/mL PDGF -BB組；⑥16 ng/mL PDGF-BB組，每組設(shè)5個復(fù)孔；細(xì)胞接種24 h后，按照分組分別加入不同培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1–2 h；在酶標(biāo)儀上測量各孔吸光度值，測定波長450 nm，重復(fù)CCK-8實(shí)驗(yàn)3次，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.7.2　hPDGF-B抗體對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)合上一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PDGF-BB濃度在4 ng/mL對HepG2細(xì)胞促增殖能力最強(qiáng)，故PDGF-BB濃度定為4 ng/mL；取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，每孔1×103個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加150 μL，周圍孔則加入PBS，置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)分組：①無血清DMEM組；② 4 ng/mL PDGF-BB組：培養(yǎng)液中加入hPDGF-BB 4 ng/mL；③Anti-hPDGF-BΔ103-118純化腹水抗體組 (1∶10始，4倍系列稀釋)；④PDGF -BB＋Anti-hPDGF-BΔ103-118純化腹水抗體組 (培養(yǎng)液中同時加入PDGF-BB 4 ng/mL和3種不同稀釋度 (1∶10始，4倍系列稀釋) 的小鼠PDGF-B純化腹水抗體)；⑤Anti-hPDGF-BΔ152-167純化腹水抗體組 (1∶10始，4倍系列稀釋)；⑥PDGF -BB＋Anti-hPDGF- BΔ152-167純化腹水抗體組 (培養(yǎng)液中同時加入PDGF-BB 4 ng/mL和3種不同稀釋度 (1∶10始，4倍系列稀釋) 的小鼠 PDGF-B純化腹水抗體)；⑦3種不同稀釋度(1∶10始，4倍系列稀釋) Trx抗體組，每組設(shè)5個復(fù)孔；細(xì)胞接種24 h后，按照分組分別加入不同培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1–2 h；在酶標(biāo)儀上測量各孔吸光度值，測定波長450 nm，重復(fù)CCK-8實(shí)驗(yàn)3次，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞增殖曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1　pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118 和 pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用PCR技術(shù)以正常人的基因組cDNA為模板分別克隆出 65 bp的 hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167編碼序列 (圖 1A)，重組質(zhì)粒pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118和pET28-Trx-hPDGFBΔ152-167經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后，消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳可見394 bp酶切片段 (圖1B)；基因測序結(jié)果正確。

2.2　6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118 及 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白的原核表達(dá)和純化

重組質(zhì)粒 pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118和pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167以及對照空質(zhì)粒pET28轉(zhuǎn)化入BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)菌，次日LB半固體平板生長菌落數(shù)較多，挑取單克隆菌落在卡那霉素抗性 LB液體培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，12% SDS-PAGE可見約16.3 kDa的6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白和16.4 kDa的6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白表達(dá)條帶；BL21(DE3)-pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118和 BL21(DE3)-pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167 表達(dá)蛋白經(jīng) Ni-NTA純化后可見相同大小的重組蛋白純化條帶 (圖2)。

圖1　目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定Fig. 1 Amplification products of target genes and identification of the recombinant plasmids by PCR and restriction enzyme analysis. (A) Amplification products of hPDGF-BΔ103-118 and hPDGF-BΔ152-167 gene with PCR. M: 50 bp Ladder DNA marker; 1,2:PDGF-BΔ103-118 and hPDGF- BΔ152-167 amplified fragments. (B) Identification of the recombinant plasmids pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118 and pET28-Trx-hPDGFBΔ152-167 by PCR and restriction enzyme analysis. M:DNA ladder mix; 1–3: pET28-Trx,pET28-TrxhPDGF-BΔ103-118,pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167.

2.3　ELISA法測定血清hPDGF-B抗體滴度結(jié)果

分別用6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白和 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白免疫小鼠，這兩種重組蛋白免疫小鼠后抗體滴度很快就達(dá)到1∶8 000，而且組間差異較小 (表2和表3)。

圖2　SDS-PAGE分析純化前后的6×his Trx-hPDGFBΔ103-118及 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白Fig. 2　SDS-PAGE analysis of expressed and purified 6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118 and 6×his Trx-hPDGFBΔ152-167 proteins. M: unstained protein marker; 1:pET28-E. coli BL21(DE3); 2: pET28-Trx-PDGF103-118-E. coli BL21(DE3); 3: pET28-Trx-PDGF103-118(purified by Ni-NTA); 4: pET28-Trx-PDGF152-167-E. coli BL21(DE3); 5: pET28-Trx-PDGF152-167 (purified by Ni-NTA).

表2　6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白免疫小鼠血清抗體滴度 (pET28-PDGF-B重組蛋白包板)Table 2　pET28-PDGF-B recombinant protein detected antibody titers in 6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118 mice antisera

表3　6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白免疫小鼠血清抗體滴度 (pET28-PDGF-B重組蛋白包板)Table 3　pET28-PDGF-B recombinant protein detected antibody titers in 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167 mice antisera

2.4　成功制備并純化hPDGF-B腹水抗體

2.4.1　ELISA法測定hPDGF-B純化前后腹水抗體滴度結(jié)果。

純化后Anti-hPDGFΔ103-118組和AntihPDGFΔ152-167組腹水抗體滴度均達(dá)到1∶16 000及以上，具有較為理想的抗體滴度 (表4)。

2.4.2　Western blotting驗(yàn)證hPDGF-B純化腹水抗體結(jié)果

Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)，兩種hPDGF-B純化腹水抗體 (1∶500) 均能和 pET28-PDGF-B重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，在33 kDa處可見PDGF-B重組蛋白條帶。純化后的hPDGF-B腹水抗體可以與膜結(jié)合PDGF-B結(jié)合，可用于下游實(shí)驗(yàn) (圖3)。

2.5　PDGF-BB對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDGF-BB對HepG2細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，PDGF-BB各濃度組與對照組相比，細(xì)胞體外生長速度明顯加快 (P<0.05)。增殖曲線顯示 PDGF-BB促細(xì)胞增殖的作用與生長因子濃度呈峰形狀相關(guān)，4 ng/mL濃度時作用最強(qiáng) (圖4)。

表4　純化前后 Anti-hPDGFΔ103-118組和 AntihPDGFΔ152-167組腹水抗體滴度 (pET28-PDGF-B重組蛋白包板)Table 4　pET28-PDGF-B recombinant protein detected ascite antibody titers of Anti-hPDGFΔ103-118 and Anti-hPDGFΔ152-167 　groups 　before 　and 　after purification

圖3　Western blotting檢測純化后的hPDGF-B腹水抗體與pET28-PDGF-B重組蛋白的結(jié)合反應(yīng)Fig. 3　Western blotting analysis of purified hPDGF-B ascites antibody responses to pET28-PDGF-B proteins. 1:anti-hPDGFΔ103-118 antibody; 2: anti-hPDGFΔ152-167 antibody; 3: His tag antibody.

圖4　PDGF-BB對HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig. 4　Positive effect of PDGF-BB on HepG2 cells proliferation. Compared with the control group,the growth rate of the HepG2 cells was obviously accelerated in different PDGF-BB concentration groups (P<0.05).

2.6　hPDGF-B腹水抗體對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 ng/mL PDGF-BB組和對照組相比明顯促HepG2細(xì)胞增殖，同時兩種PDGF-B純化腹水抗體均能明顯抑制PDGF-BB所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，隨著抗體濃度的增加，對細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，組間差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) (表5)。

表5　hPDGF-B抗體對HepG2細(xì)胞增殖的影響Table 5　Inhibitory effect of Anti-hPDGF-B antibodies on HepG2 cell proliferation

圖5　hPDGF-B抗體對HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig. 5　Inhibitory effect of Anti-hPDGF-B antibodies on HepG2 cell proliferation. Compared with serum-free medium group,the growth rate of the HepG2 cells was obviously inhibited in Anti-hPDGF-BΔ103-118 antibody groups (1:10 dilution and 1:40 dilution) and Anti-hPDGF-BΔ152-167 antibody groups (1:10 dilution and 1:40 dilution; P<0.05).Compared with 4 ng/mL PDGF-BB group,the growth rate of the HepG2 cells was obviously inhibited in PDGF-BB+Anti-hPDGF-BΔ103-118 antibody groups (1:10 dilution and 1:40 dilution) and PDGF-BB+Anti-hPDGFBΔ152-167 antibody groups (1:10 dilution and 1:40 dilution; P<0.05).

3　討論

肝細(xì)胞癌 (HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，由于起病隱匿、病情發(fā)展迅速、手術(shù)復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，中晚期肝癌的治療效果并不理想，故現(xiàn)在迫切需要探索新的有效治療方法。

PDGF作為已有 30余年歷史的肽類生長因子，最初發(fā)現(xiàn)其為一種重要的促有絲分裂因子，主要作用于成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)PDGF既參與重要的生理活動，如胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)及組織修復(fù)等，同時又與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如肝纖維化、心肌過度纖維化、結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤、前列腺癌等[10-11]。PDGF及其受體的過度表達(dá)是腫瘤常見的特征之一，在皮膚癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中均可檢測到高表達(dá)水平的PDGF及其受體[8]。研究發(fā)現(xiàn)PDGF與其受體結(jié)合后可使受體酪氨酸激酶激活，從而激活細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要通過自分泌的形式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，也可通過旁分泌的形式促進(jìn)血管和淋巴管的生成，調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的生成和降解[12-14]。目前認(rèn)為PDGF可能主要通過 3個方面促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展：腫瘤細(xì)胞自分泌刺激；刺激血管生成；腫瘤微環(huán)境的調(diào)控。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn) PDGF在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程可能發(fā)揮重要作用[15-17]，這提示我們PDGF及其受體可能作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

肝癌的發(fā)生和發(fā)展與多種細(xì)胞因子有關(guān)，而且涉及多條信號通路，如何在療效和毒副作用之間選擇最佳的治療方法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前對于中晚期肝癌臨床上尚缺乏安全、有效的治療方法，雖然多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑索拉非尼通過對酪氨酸激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶的抑制作用明顯延長了晚期肝癌患者的生存期[4]，但是由于價格較高，而且在用藥過程中存在較多的毒副作用，限制了其在臨床上的應(yīng)用。鑒于PDGF在腫瘤細(xì)胞自分泌刺激、促進(jìn)血管生成及對調(diào)控腫瘤微環(huán)境的作用，我們認(rèn)為有必要研究和開發(fā)高效、方便、安全、價廉的阻斷PDGF的藥物或手段?？紤]到完全阻斷 PDGF/PDGFR信號通路技術(shù)難度較大，而且可能引起較多的毒副作用，仔細(xì)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)PDGF-B相較于其他幾種亞型結(jié)構(gòu)研究最為清楚，而且在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，我們認(rèn)為選擇性地阻斷 PDGF-B有望達(dá)到理想效果。目前阻斷PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法主要有基因沉默、DNA適配子、PDGF可溶性受體及受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑等[18-21]，但是由于技術(shù)難度大，價格高昂、副作用大等缺點(diǎn)難以在臨床推廣使用。相較于上述幾種阻斷PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，細(xì)胞因子疫苗通過基因工程改造過的大腸桿菌表達(dá)，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性PDGF抗體，不會整合到免疫動物基因組，也不會產(chǎn)生強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)；而且國內(nèi)外動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子疫苗不會造成其他正常器官的損傷，因此PDGF-B疫苗有治療高效、制作方法簡單、使用方便、作用持久等無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤治療中有良好的臨床應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)通過PDGF-B重組蛋白主動免疫的方式，刺激機(jī)體產(chǎn)生hPDGF-B抗體，觀察hPDGF-B抗體對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，旨在探討PDGF-B疫苗構(gòu)建及阻斷PDGF/PDGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在HCC治療中的可行性。實(shí)驗(yàn)中選用硫氧還蛋白融合蛋白表達(dá)體系作為原核表達(dá)載體，其在大腸桿菌中可高產(chǎn)量地表達(dá)可溶性目的蛋白質(zhì)，即通過pET28-Trx空載質(zhì)粒作為載體，向其中分別連入2段來自PDGF-B的關(guān)鍵編碼序列，經(jīng)原核表達(dá)純化出兩種重組蛋白 6×his Trx-hPDGFBΔ103-118和 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167，通過主動免疫小鼠成功制備并純化出2種PDGF-B多克隆抗體，純化后的腹水抗體滴度可達(dá)1∶16 000以上，而且抗體能與膜結(jié)合的PDGF-B反應(yīng)，證實(shí)兩種重組蛋白具有良好的免疫原性；通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 2種 PDGF-B純化腹水抗體(≥1∶40稀釋度) 均可有效抑制PDGF-BB對HepG2細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118及6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白具有較高的免疫原性，其作為免疫原均可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的PDGF-B中和性抗體，而且PDGF-B純化腹水抗體具有良好的中和活性，可有效抑制PDGF-BB對肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，這為利用不同表位組合構(gòu)建PDGF-B疫苗提供了新的方法，也為臨床上HCC的治療提供了一種新的思路。

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