劉春利，沈寧燕，倪輝, 2, 3, 4，李利君, 2, 3, 4，陳艷紅, 2, 3, 4，肖安風, 2, 3, 4*

1(集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門，361021)2(福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門，361021)3(福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門，361021)4(廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建 廈門，361021)

法夫酵母(Phaffiarhodozyma)中主要的類胡蘿卜素是胞內蝦青素，含量可達到40%～95%，且法夫酵母具有生長周期短，培養(yǎng)條件簡單，能代謝多種碳源等優(yōu)勢，成為了天然蝦青素生產的主要研究對象[14,16]。法夫酵母可以利用乙醇作為碳源進行生長。YAMANE等[17]在細胞生長的穩(wěn)定期添加0.3%的乙醇。GU等[18]在延遲期后期或對數(shù)生長期添加0.2%的乙醇，均使色素產量提高了近1倍左右。汪洪濤等[19]針對不同的法夫酵母菌株，在培養(yǎng)基中添加乙醇，均能提高法夫酵母中蝦青素的含量。

在搖瓶條件下，易于考察各種營養(yǎng)因子對發(fā)酵過程的影響，從而篩選出適宜蝦青素生產的發(fā)酵條件。本試驗對法夫酵母JMU-MVP14進行了搖瓶培養(yǎng)，對比研究不同初始糖濃度與乙醇添加濃度對法夫酵母細胞生長及蝦青素合成的影響，篩選出最利于蝦青素合成的乙醇濃度；然后，利用乙醇傳感器控制整個發(fā)酵過程維持在不同恒定乙醇濃度下，考察乙醇濃度對蝦青素合成的影響；并在此基礎上同時補加乙醇與葡萄糖，以蝦青素產量為指標，得到最佳的乙醇補料方式。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1菌種

法夫酵母PhaffiarhodozymaJMU-MVP14 菌株：用甲基磺酸乙酯對法夫酵母JMU-VDL668 菌株誘變，經0.5%的雙氧水和紫外照射來淘汰低產的菌株選育得到[20]。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：4°Bx 麥汁，pH 6.0。

無碳源培養(yǎng)基(g/L)：取KH2PO42 g，(NH4)2SO45 g，CaCl20.2 g，MgSO40.5 g，酵母膏3 g，溶于1 L蒸餾水中，調pH為6.0。

法夫酵母搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖及乙醇的添加量如表1所示，其他成分組成和無碳源培養(yǎng)基相同。

表1　培養(yǎng)基中葡萄糖及乙醇的添加量Table 1　Glucose concentration and ethanol additionwithin medium

1.1.3主要試劑

蝦青素(色譜純)，Sigma公司；無水乙醇(分析純)，廣東化學試劑；3,5-二硝基水鹽酸，國藥集團；酵母膏(優(yōu)級純)，廣東環(huán)凱；其他試劑均為分析純，購于西隴化工。

1.2　實驗儀器和設備

ZHWY-2102雙層全溫培養(yǎng)搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；1260高效液相色譜儀，安捷倫(中國)科技有限公司；SW-CJ-ZFD單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；S20K pH酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司；BS223S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；101-3B電熱鼓風干熱箱，上海市實驗儀器總廠；TD5M-WS臺式離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LDZX-40KAS立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；2600A紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；乙醇感受器，參考相關專利[21]，在某些結構上進行改良，自制了乙醇傳感器。

1.3　實驗方法

1.3.1培養(yǎng)方法

將PDA斜面活化的菌種接入種子培養(yǎng)基中，22 ℃培養(yǎng)2～3 d得1代種子，轉接1代種子到新配制的種子培養(yǎng)基為2代種子，轉接2代種子到搖瓶中，于22 ℃連續(xù)培養(yǎng)120 h，每24 h取樣檢測生物量、蝦青素產量及殘?zhí)呛?，用乙醇傳感器檢測乙醇質量濃度。

1.3.2生物量的測定

1.3.3蝦青素含量的測定

二甲基亞砜(DMSO)法破壁[23-24]：取5 mL發(fā)酵液離心2次后去上清液得到菌體。將菌體于55 ℃下預熱5 min后，加入2 mL已預熱至75 ℃的二甲基亞砜，充分振蕩后加入5 mL乙醇提取色素，離心得到色素提取液，乙醇定容至10 mL。

紫外分光光度計法檢測[25]：配制不同濃度梯度的蝦青素標準品，在紫外光波長為474 nm下檢測，繪制出蝦青素標準曲線。相同條件下，測定發(fā)酵樣品吸光度，根據(jù)標準曲線求樣品中的蝦青素含量。

1.3.4發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y定

3,5-二硝基水楊酸法(DNS)[26]：1 mL的發(fā)酵上清液稀釋至適宜濃度，加入0.6 mL的DNS，沸水浴10 min后立即冷卻，用蒸餾水定容至5 mL，使用紫外分光光度計在波長為520 nm下測定。

1.3.5發(fā)酵液中乙醇質量濃度的測定

將配制好的2 g/L的乙醇標準溶液，稀釋后分裝于相同規(guī)格的50 mL離心管中，每管5 mL，用于測定乙醇標準曲線。于室溫22 ℃下，乙醇傳感器1提前預熱30 min，待讀數(shù)為0，將傳感器感應端置于離心管樣品液面上0.5 cm處，秒表計時50 s后讀數(shù)。取出傳感器感應端置于空氣中，待讀數(shù)為0后測定下一個樣品。

1.3.6二次參數(shù)的計算

2　結果與討論

2.1　不同初始糖濃度時添加乙醇對發(fā)酵的影響

分別在10 g/L和20 g/L兩種葡萄糖濃度發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度乙醇，考察乙醇對搖瓶培養(yǎng)法夫酵母JMU-MVP14的細胞生長和蝦青素合成的影響。乙醇會對法夫酵母和蝦青素合成產生影響。

2.1.1初始葡萄糖質量濃度為10 g/L時添加乙醇對發(fā)酵的影響

以無碳源培養(yǎng)基為基礎，添加10 g/L的葡萄糖，乙醇的添加濃度如表1所示?？疾煸谳^低糖濃度下，不同乙醇濃度對法夫酵母整個發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗、細胞生長、蝦青素的積累及乙醇濃度的變化情況如圖1所示。

□-不添加乙醇；■-添加1 g/L乙醇；△-添加2 g/L；▲-添加5 g/L乙醇；●-添加20 g/L乙醇圖1　初始葡萄糖質量濃度為10 g/L時添加乙醇對法夫酵母JMU-MVP14發(fā)酵的影響Fig. 1　The effect of ethanol addtion on astaxanthin production by P. rhodozyma JMU-MVP14 at the initial concentration of10 g/L glucose

由圖1-a可知，添加0～5 g/L的乙醇培養(yǎng)條件下，生物量曲線變化趨勢基本一致，發(fā)酵至48 h達到穩(wěn)定期，48 h以后基本不變，且與對照組(不添加乙醇)相比，添加0～5 g/L的乙醇對法夫酵母JMU-MVP14生物量影響差別不顯著。從圖1-b可看出，對照組蝦青素產量在72 h達到最大，72 h后蝦青素產量保持穩(wěn)定，但添加乙醇后，法夫酵母在72 h后蝦青素產量進一步提高。當添加乙醇的質量濃度為2 g/L和5 g/L時，蝦青素質量濃度均達到最高水平40.0 mg/L，比對照組顯著提高了70%，且此時蝦青素細胞產率分別達到了10.0 mg/g和11.3 mg/g，與陳鋒等[27]的研究結果一致。

結合圖1-c和圖1-d，與對照組相比，添加1～2 g/L的乙醇時，酵母消耗葡萄糖的速度加快，且發(fā)酵至24 h，酵母不再消耗葡萄糖，開始使用乙醇，葡萄糖最終利用率均能達到78.0%，乙醇最終利用率達到80.0%；而添加5 g/L的乙醇，酵母發(fā)酵48 h后，才開始利用乙醇，乙醇最終利用率為93.4%，葡萄糖最終利用率只有68.2%。由此推測，在葡萄糖和乙醇共同存在的情況下，法夫酵母優(yōu)先利用葡萄糖生長，再利用乙醇，且乙醇能替代葡萄糖作為碳源使酵母產蝦青素，與HU等[28]的文獻報道一致。而當培養(yǎng)基中乙醇的質量濃度增至20 g/L時，法夫酵母生長至24 h就停止生長，對葡萄糖的利用率降低，發(fā)酵結束后，生物量質量濃度和蝦青素質量濃度同對照組相比差異顯著，分別降低至對照組的27%和14%。說明添加低濃度的乙醇可以促進法夫酵母產蝦青素，而添加較高濃度乙醇抑制酵母細胞的生長和蝦青素的積累。

2.1.2初始葡萄糖質量濃度為20 g/L時添加乙醇對發(fā)酵的影響

在較低糖濃度時，當添加2 g/L和5 g/L乙醇時，蝦青素產量均達到最高，且與對照組相比，添加1～2 g/L質量濃度的乙醇，酵母消耗葡萄糖量的速度加快，因此將培養(yǎng)基中初始葡萄糖質量濃度提高為20 g/L，其他培養(yǎng)條件不變時，進一步考察在較高糖濃度下添加乙醇對法夫酵母JUM-MVP14發(fā)酵過程中細胞生長、蝦青素合成、乙醇利用等方面的影響。結果如圖2所示。

如圖2-a所示，添加1～2 g/L的乙醇促進了細胞生長和蝦青素的積累。且添加1 g/L的乙醇使得生物量較對照組提高了18%。從蝦青素質量濃度曲線圖2-b可看出，添加1 g/L的乙醇，發(fā)酵至120 h，蝦青素質量濃度為42.0 mg/L，比對照組顯著提高了26.9%，此時乙醇的最終利用率為84.0%，蝦青素細胞產率為10.5 mg/g，比對照組提高了7.1%。本試驗結果與肖安風等[29]的研究發(fā)現(xiàn)一致，乙醇作為糖代謝途徑中的相關產物，可為蝦青素合成提供更多的乙酰輔酶A，從而提高了蝦青素的產量。

□-不添加乙醇；■-添加1 g/L乙醇；△-添加2 g/L；▲-添加5 g/L乙醇；○-添加10 g/L乙醇；●-添加20 g/L乙醇圖2　初始葡萄糖質量濃度為20 g/L時添加乙醇對法夫酵母JMU-MVP14發(fā)酵的影響Fig. 2　The effect of ethanol addtion on astaxanthin production by P. rhodozyma JMU-MVP14 at the initial concentration of20 g/L glucose

從殘?zhí)呛康淖兓闆r發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵進入對數(shù)生長期后，細胞代謝旺盛，對碳源的需求增大，從而殘?zhí)呛垦杆傧陆担?2 h之后，菌體生長趨于穩(wěn)定，糖含量下降速度明顯減緩。其中，添加1 g/L乙醇顯著提高了法夫酵母JUM-MVP14對葡萄糖的利用率，可達75.0%(比對照組顯著提高了36.4%)，加快了其對葡萄糖的代謝，產生更多的乙酰輔酶A[29]，為蝦青素的合成提供原料，從而進一步闡明低濃度乙醇能促進法夫酵母蝦青素合成。但和初始葡萄糖濃度為10 g/L時相比，酵母對葡萄糖的利用率明顯降低，且蝦青素的產量卻無顯著提高。

2.2　控制恒定乙醇的濃度及補加葡萄糖對發(fā)酵的影響

由2.1的試驗結果可知，乙醇能顯著促進法夫酵母JMU-MVP14菌株細胞生長及蝦青素的合成，為進一步研究乙醇在整個法夫酵母發(fā)酵周期中對蝦青素合成的影響，采用乙醇傳感器實時在線檢測乙醇濃度，發(fā)酵過程補加乙醇,使整個發(fā)酵周期中乙醇能維持在一個恒定的濃度。

2.2.1控制恒定乙醇的濃度對發(fā)酵的影響

在較高葡萄糖濃度環(huán)境中，法夫酵母對糖的利用率降低，且蝦青素的產量沒有明顯提高。因此用初始葡萄糖質量濃度為10 g/L的培養(yǎng)基，空白組設為只添加2 g/L的乙醇，實驗組用乙醇傳感器檢測乙醇濃度在整個發(fā)酵過程中維持2 g/L?？疾旌愣ㄒ掖佳a料策略對法夫酵母整個發(fā)酵過程中生物量、殘?zhí)?、蝦青素產量等發(fā)酵參數(shù)的變化情況。實驗結果如圖3所示。

由圖3-a可知，乙醇持續(xù)補加，JMU-MVP14菌株的細胞生長至后期，其生物量提高了，說明此菌株可利用乙醇來合成自身的物質，即達到穩(wěn)定期后仍可利用乙醇繼續(xù)生長，與HU等[28]文獻報道一致。在酵母培養(yǎng)過程中控制恒定乙醇濃度，從24 h開始蝦青素合成量呈對數(shù)增長趨勢，發(fā)酵至120 h蝦青素質量濃度為50.1 mg/L，比對照組提高了20.3%。從圖3-c可知，實驗組和對照組葡萄糖的利用率均能達到77.2%以上。結合圖3-d可以看出，乙醇提高了單位細胞內蝦青素的產量(13.1 mg/g)，比對照組(12.2 mg/g)提高了7.4%，進而從總體上提高了JMU-MVP14菌株的蝦青素合成能力。說明恒定乙醇控制策略更有利于法夫酵母蝦青素的合成。

2.2.2控制恒定乙醇濃度并補加葡萄糖對JMU-MVP14發(fā)酵的影響

前期的研究結果表明，在較低糖質量濃度(10 g/L)培養(yǎng)基中，添加乙醇，蝦青素質量濃度達到最高水平40.0 mg/L，在高糖質量濃度(20 g/L)培養(yǎng)基中，添加乙醇，蝦青素質量濃度為42.0 mg/L，后者比前者多了5%，說明乙醇對法夫酵母產蝦青素的作用與葡萄糖濃度密切相關。故以無碳源培養(yǎng)基為基礎，添加10 g/L的葡萄糖，設置3個實驗組，即只補加葡萄糖、只補加乙醇、同時補加葡萄糖和乙醇，空白對照只添加2 g/L的乙醇，同時不補加乙醇也不補加葡萄糖，考察乙醇及葡萄糖的搖瓶補料策略對法夫酵母整個發(fā)酵過程中生物量、殘?zhí)?、蝦青素產量等發(fā)酵參數(shù)的變化情況。試驗結果如圖4所示。

□-對照組；■-添加乙醇的實驗組圖3　控制恒定乙醇濃度對法夫酵母JMU-MVP14發(fā)酵的影響Fig. 3　Fermentation curves of P. rhodozyma JMU-MVP14 at the constant concentration of 2 g/L ethanol

□-對照組；■-只補加乙醇的實驗組；△-只補加葡萄糖的實驗組；▲-補加乙醇和葡萄糖的實驗組圖4　乙醇補料策略對法夫酵母JMU-MVP14發(fā)酵的影響Fig.4　The effect of fermentation parameters in fed-batch process with ethanol by P. rhodozyma JMU-MVP14 inshaking flask fermentation

在搖瓶發(fā)酵的3種補料方式中，將乙醇質量濃度控制在2 g/L左右，對法夫酵母JMU-MVP14細胞生長最有利，生物量質量濃度最大為3.2 g/L。而在只補加葡萄糖的情況下對法夫酵母細胞生長有抑制作用。結合發(fā)酵液殘?zhí)堑淖兓€可知，每24 h補加5 g/L葡萄糖并未被法夫酵母JMU-MVP14菌株所利用，而是在發(fā)酵液中累積，從而造成發(fā)酵液中葡萄糖的濃度升高。且每24 h補加葡萄糖，較對照組并未使菌體的生物量增加，但促進了蝦青素的合成，這與相關文獻報道相一致，高C/N導致細胞生長減慢，但有利于蝦青素的積累[30]。法夫酵母JMU-MVP14菌株的3種補料方式中，從蝦青素質量濃度變化曲線可知，乙醇和葡萄糖的補加能都促進蝦青素的合成，以控制恒定2 g/L乙醇質量濃度并每24 h補加5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)條件下，蝦青素產量達到最大值55.3 mg/L，與對照組比顯著提高44.4%，比只補加乙醇顯著提高了17.4%。圖4-d表明：同時補加乙醇和葡萄糖，法夫酵母在發(fā)酵120 h其蝦青素細胞產率為19.7 mg/g，比對照組(14.1 mg/g)顯著提高，達到39.7%，比只補加葡萄糖(17.7 mg/g)提高了11.3%，比只補加乙醇16.3 mg/g提高了20.9%。由此可知，同時補加葡萄糖和乙醇有利于法夫酵母JMU-MVP14菌株細胞內蝦青素的合成。

3　結論

考察乙醇對高產蝦青素的法夫酵母菌株JMU-MVP14合成蝦青素的影響，在10 g/L和20 g/L兩種葡萄糖質量濃度下，向培養(yǎng)基中添加1 g/L和2 g/L的乙醇時，均可提高蝦青素的產量；而添加20 g/L的乙醇時，則會抑制法夫酵母的細胞生長和蝦青素的產生。在法夫酵母培養(yǎng)基中初始葡萄糖質量濃度10 g/L的條件下，通過補加乙醇控制發(fā)酵液中乙醇的質量濃度恒定為2 g/L，蝦青素質量濃度為50.1 mg/L，比只在發(fā)酵初始階段添加2 g/L的乙醇，蝦青素質量濃度提高了20.3%，蝦青素細胞產率提高了7.4%，說明恒定乙醇控制策略更有利于法夫酵母蝦青素的合成。在較低糖質量濃度(10 g/L)培養(yǎng)基中，添加乙醇，蝦青素質量濃度最高水平達到40.0 mg/L，在高糖質量濃度(20 g/L)培養(yǎng)基中，添加乙醇，蝦青素質量濃度達到42.0 mg/L，后者比前者多了5%，說明乙醇對法夫酵母產蝦青素的作用與葡萄糖質量濃度密切相關。以10 g/L的葡萄糖質量濃度為初始培養(yǎng)基，補料控制整個發(fā)酵過程中乙醇質量濃度為2 g/L，并每24 h補加5 g/L葡萄糖，蝦青素產量顯著提高，最大值為55.3 mg/L，比對照組提高了44.4%，比只補加乙醇提高了17.4%；并且法夫酵母在發(fā)酵120 h其蝦青素細胞產率為19.7 mg/g，比對照組(14.1 mg/g)提高了39.7%，比只補加葡萄糖(17.7 mg/g)提高了11.3%，比只補加乙醇16.3 mg/g提高了20.9%。由此可知，同時補加葡萄糖和乙醇有利于法夫酵母JMU-MVP14菌株細胞內蝦青素的合成。但是每24 h補加5 g/L葡萄糖并未被法夫酵母JMU-MVP14菌株所利用，而是在發(fā)酵液中累積，從而造成葡萄糖最終利用率降低，因此后續(xù)試驗，繼續(xù)對法夫酵母產蝦青素發(fā)酵過程中葡萄糖補加的量和時間進行條件優(yōu)化。

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