田莉峰，伍瓊芳，譚俊，蘇瓊，李游，許定飛

(江西省婦幼保健院輔助生殖中心，南昌　330006)

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，臨床促排卵方案得以?xún)?yōu)化，個(gè)體化用藥越來(lái)越受到重視。對(duì)于兩細(xì)胞-兩性腺學(xué)說(shuō)的深入研究發(fā)現(xiàn)，不同激素在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的不同階段發(fā)揮不同作用。黃體生成素(LH)可以促進(jìn)雌激素合成、誘導(dǎo)卵泡發(fā)育與成熟、選擇主導(dǎo)卵泡，還能在月經(jīng)中期恢復(fù)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂、誘發(fā)排卵。在輔助生殖技術(shù)中，使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)臨床應(yīng)用廣泛，可有效預(yù)防LH峰的提前出現(xiàn)，但由于患者對(duì)GnRH-a的反應(yīng)存在個(gè)體差異，也可能引起垂體降調(diào)節(jié)后血清LH水平過(guò)度抑制狀態(tài)。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于添加LH的研究很多，主要集中在GnRH-a黃體期長(zhǎng)方案和GnRH拮抗劑(GnRH-ant)方案[1-2]，以及高齡婦女中[3]。GnRH-a黃體期長(zhǎng)方案和GnRH-ant方案中添加LH的研究結(jié)果顯示：在降調(diào)節(jié)后，患者內(nèi)源性LH會(huì)受到過(guò)度抑制，并且E2合成受到影響，而添加LH可以減少顆粒細(xì)胞凋亡，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎質(zhì)量，增加卵母細(xì)胞成熟度[1-2]。但目前關(guān)于GnRH-a早卵泡期長(zhǎng)方案中添加LH的相關(guān)研究較少。我中心多年的臨床數(shù)據(jù)顯示，早卵泡期長(zhǎng)方案與黃體期長(zhǎng)方案和拮抗劑方案比較，有提高種植率和臨床妊娠率的優(yōu)勢(shì)[4-7]，因此該方案在我中心廣泛使用。因?yàn)镚nRH-a早卵泡期長(zhǎng)方案中的全量GnRH-a有充分的降調(diào)節(jié)作用，促排卵過(guò)程中血清LH值比黃體期長(zhǎng)方案和拮抗劑方案中LH值均明顯降低，過(guò)低的LH可能影響卵母細(xì)胞成熟度，所以，理論上補(bǔ)充LH可以增加成熟卵母細(xì)胞數(shù)量，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎質(zhì)量，提高胚胎種植率及臨床妊娠率等。為了進(jìn)一步優(yōu)化早卵泡期長(zhǎng)方案，本研究回顧性分析早卵泡期長(zhǎng)方案促排卵過(guò)程中對(duì)于血清LH值低的患者給予r-LH處理，探討添加r-LH是否改善患者的臨床結(jié)局。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

收集2013年1月至2015年12月在本生殖中心行IVF/ICSI-ET，采用早卵泡期長(zhǎng)方案的不孕患者為研究對(duì)象(共1 331個(gè)周期)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)不孕年限>1年；(2)年齡20～45歲；(3)基礎(chǔ)FSH<12 U/L；(4)促排卵后第8天(D8)血清LH水平≤0.5 U/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在子宮畸形，如雙子宮、雙角子宮、單角子宮、子宮縱膈等，合并宮腔粘連、子宮腺肌癥、子宮肌瘤[粘膜下肌瘤或子宮肌層肌瘤但直徑>4 cm和(或)壓迫子宮內(nèi)膜]；(2)夫婦雙方任意一方染色體異常；(3)曾有3次及以上復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病史(包括生化妊娠流產(chǎn))等；(4)合并存在其他輔助生殖禁忌癥的患者：如未控制的糖尿病、肝腎功能異常、未控制的高血壓、心臟病等，有腦血管意外或深靜脈血栓史，合并生殖系統(tǒng)癌癥或相關(guān)病史，存在未明確診斷的陰道流血等。

按照治療時(shí)是否添加重組人黃體生成素(r-LH)將患者分為觀察組和對(duì)照組。觀察組(689個(gè)周期)：D8開(kāi)始添加r-LH至HCG日；對(duì)照組(642個(gè)周期)則不添加r-LH。

二、研究方法

早卵泡期長(zhǎng)方案：患者于月經(jīng)第2天肌肉注射長(zhǎng)效GnRH-a(醋酸曲普瑞林，達(dá)菲林，3.75 mg/支，博福-益普生，法國(guó))3.75 mg進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，28～30 d后行B超及內(nèi)分泌激素檢查，達(dá)到垂體完全降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)(子宮內(nèi)膜厚度≤5 mm，血清FSH<5 U/L，黃體生成素LH<5 U/L，E2<183 pmol/L)后，每天給予75～225 U重組人卵泡刺激素(r-FSH，果納芬，75 U/支或450 U/支，默克雪蘭諾，德國(guó))啟動(dòng)促排卵周期。并根據(jù)患者年齡、體重及卵巢反應(yīng)情況調(diào)整劑量。

觀察組(果納芬+樂(lè)芮組)患者D8開(kāi)始每天添加r-LH(樂(lè)芮，75 U/支，默克雪蘭諾，德國(guó))1支，至HCG注射日。對(duì)照組(果納芬組)患者則不添加r-LH，繼續(xù)r-FSH促排卵，直至HCG注射日。

給予Gn 5 d后行陰式B超檢查監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育大小，同時(shí)監(jiān)測(cè)血清LH、E2及孕酮(P)水平，根據(jù)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的速度調(diào)整Gn具體用量，直至 HCG 注射日。當(dāng)至少有1個(gè)卵泡直徑≥19 mm或2個(gè)卵泡直徑≥18 mm時(shí)于當(dāng)晚給予HCG(艾澤，250 μg/支，默克雪蘭諾，德國(guó))250 μg皮下注射，36 h后在陰道B超引導(dǎo)下取卵。取卵當(dāng)日給予黃體酮針劑(黃體酮注射液，20 mg/支，浙江仙琚)60 mg/d進(jìn)行黃體支持。卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)3～6 h后進(jìn)行常規(guī)IVF或ICSI，于受精后第3天或第5～6天，選擇最優(yōu)質(zhì)的胚胎1～2枚在腹部B超引導(dǎo)下進(jìn)行移植。

優(yōu)質(zhì)胚胎：D3細(xì)胞數(shù)7～9個(gè)的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎；優(yōu)質(zhì)囊胚：D5～6囊胚分級(jí)≥3級(jí)，且其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)為A或B級(jí)。

對(duì)獲卵數(shù)≥20個(gè)或移植前卵巢直徑≥7 cm者，考慮移植后有中重度卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)發(fā)生的可能，這類(lèi)患者行全胚冷凍。移植后改用黃體酮陰道緩釋凝膠8%(雪諾酮90 mg/支，默克雪蘭諾，德國(guó))1支/d，及地屈孕酮片(達(dá)芙通10 mg/片，蘇威制藥，荷蘭)早晚各1片行黃體支持。移植后13 d驗(yàn)?zāi)騂CG或查血HCG確定是否生化妊娠，移植后1個(gè)月行B超檢查見(jiàn)胚芽及胎心搏動(dòng)者診斷為臨床妊娠，并同時(shí)確定孕囊數(shù)。黃體支持從取卵日開(kāi)始維持至孕10周。隨訪孕期及分娩時(shí)母嬰情況等。

三、觀察指標(biāo)

主要觀察指標(biāo)為抱嬰率、臨床妊娠率及胚胎種植率；次要觀察指標(biāo)為Gn天數(shù)、Gn總量及獲卵數(shù)、注射HCG日LH、E2和P水平、HCG日內(nèi)膜厚度、MⅡ卵率、雙原核(2PN)受精率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、早期流產(chǎn)率、全胚冷凍率、OHSS發(fā)生率，以及產(chǎn)婦分娩孕周、新生兒出生體重等。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、兩組患者基本情況比較

兩組基本情況比較，年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)、基礎(chǔ)性激素水平等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者促排卵情況比較

兩組患者降調(diào)節(jié)后血FSH、LH、E2水平，HCG日LH水平、HCG日內(nèi)膜厚度，Gn天數(shù)、Gn總量比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。觀察組患者HCG日P水平、E2水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(表2)。

表1　兩組患者基本情況比較(-±s)

表2　兩組患者促排卵情況比較(-±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

三、兩組患者臨床結(jié)局比較

觀察組的獲卵數(shù)、每周期平均冷凍胚胎數(shù)及全胚冷凍率均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。觀察組的MⅡ卵率、種植率、臨床妊娠率、每周期抱嬰率均略高于對(duì)照組，但是無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3　兩組患者臨床結(jié)局的比較 [(-±s)，%]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；a種植率、臨床妊娠率和抱嬰率均按每移植周期計(jì)算

討　　論

基于兩細(xì)胞-兩性腺學(xué)說(shuō)，LH和FSH在卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵及相互協(xié)同的作用，卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞產(chǎn)生卵巢類(lèi)固醇激素[8-9]。FSH在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育早期是必不可少的，并且通過(guò)芳香化酶將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，而雄激素的產(chǎn)生是卵泡膜細(xì)胞在LH和FSH共同作用下將膽固醇轉(zhuǎn)化為雄激素[10]。雖然在沒(méi)有LH的情況下，F(xiàn)SH也可以誘導(dǎo)卵泡生長(zhǎng)，但是在注射了HCG后，卵泡仍然可能出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育缺陷，說(shuō)明LH在卵泡發(fā)育過(guò)程中不僅是為芳香化酶提供雄激素底物，而且直接刺激和調(diào)節(jié)卵泡形成。值得注意的是，卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的孕激素可以在LH的影響下轉(zhuǎn)化成雄激素。因此，LH的補(bǔ)充可以引起血清P水平降低。眾所周知，過(guò)高的P對(duì)內(nèi)膜有不利的影響，導(dǎo)致內(nèi)膜和胚胎的非同步發(fā)育，降低種植率。本研究結(jié)果與此一致，觀察組HCG日P水平低于對(duì)照組，較低的孕激素可能有利于內(nèi)膜容受性，使觀察組臨床妊娠率有高于對(duì)照組的趨勢(shì)，雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。LH在卵泡發(fā)育成熟過(guò)程中起著必不可少的作用，當(dāng)卵泡發(fā)育至對(duì)FSH有反應(yīng)的階段，顆粒細(xì)胞逐漸表達(dá)LH受體，開(kāi)始接受LH的刺激，LH作用在卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞上，發(fā)揮FSH的大部分生物活性，包括對(duì)芳香化酶系統(tǒng)的刺激。因而，此時(shí)受FSH刺激的卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞對(duì)FSH和LH可以產(chǎn)生類(lèi)似的反應(yīng)，尤其在FSH和LH非飽和劑量的狀態(tài)下，二者協(xié)同作用，反應(yīng)疊加[11]。另外，公認(rèn)為卵泡成熟通過(guò)顆粒細(xì)胞上逐漸表達(dá)的LH受體而減少了對(duì)FSH的依賴(lài)。提示LH可能在卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程中起著關(guān)鍵性決定作用。但是，發(fā)育的卵泡暴露在不合適的高濃度LH中可能會(huì)干擾卵泡和卵母細(xì)胞的成熟，從而對(duì)生殖過(guò)程帶來(lái)副作用。GnRH-a降調(diào)節(jié)藥物的使用，能有效抑制促排卵過(guò)程中LH峰的提前出現(xiàn)，卻增加了LH的過(guò)度抑制。因此，促排卵過(guò)程中是否應(yīng)該添加LH，以及添加LH的時(shí)機(jī)和劑量等成為目前輔助生殖領(lǐng)域?qū)W者討論的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

卵泡發(fā)育和成熟需要最低閾值水平的LH，1%的LH受體被利用就足以維持類(lèi)固醇的合成，但是如果LH低于閾值，則影響卵泡生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞成熟，減少雄激素和雌激素的合成[12]。Gordon等[13]研究認(rèn)為，降調(diào)節(jié)后較低的內(nèi)源性LH對(duì)于卵巢的正常反應(yīng)和E2合成是充足的，但添加外源性LH可以增加胚胎著床率。LH超過(guò)發(fā)育卵泡的峰值可以終止卵泡發(fā)育：LH高于峰值，會(huì)抑制顆粒細(xì)胞增殖，導(dǎo)致卵泡閉鎖、黃素化。增加LH劑量，使LH高于峰值可減少小卵泡數(shù)[12]。在本研究中，觀察組添加外源性LH后，獲卵數(shù)減少，導(dǎo)致HCG日雌激素水平較對(duì)照組低，降低了OHSS風(fēng)險(xiǎn)，可使觀察組患者鮮胚移植概率增高，而觀察組因預(yù)防OHSS進(jìn)行全胚冷凍的患者減少，全胚冷凍率降低。觀察組在獲卵數(shù)下降、移植率增高的情況下，每周期冷凍胚胎數(shù)目較對(duì)照組顯著降低。有研究表明，在內(nèi)源性LH被抑制的IVF周期中，要想獲得理想的卵泡發(fā)育，血清LH值最好維持在1.2～5.0 U/L之間[14]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于添加r-LH是否獲益，及獲卵數(shù)、妊娠率等結(jié)局指標(biāo)仍存在爭(zhēng)議。這可能和研究設(shè)計(jì)針對(duì)了不同卵巢儲(chǔ)備、不同年齡的患者及采用不同的促排卵方案有關(guān)。Razi等[15]的一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)顯示，對(duì)于年輕的卵巢功能正常的不孕患者，使用黃體期長(zhǎng)方案，添加r-LH對(duì)妊娠結(jié)局沒(méi)有改善。Oliveira等[16]進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)，在GnRH-a長(zhǎng)方案降調(diào)節(jié)周期中，促排卵早期(刺激第6天)開(kāi)始添加r-LH會(huì)縮短刺激天數(shù)，減少Gn用量，增加HCG日雌激素水平；然而，獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、每取卵周期臨床妊娠率、著床率以及流產(chǎn)率無(wú)顯著性差異。Santi等[17]的另一項(xiàng)Meta分析數(shù)據(jù)顯示，IVF/ICSI-ET助孕治療中，F(xiàn)SH+LH治療組有更少的卵母細(xì)胞數(shù)和更高的妊娠率，MⅡ卵數(shù)各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。添加r-LH或LH活性物質(zhì)可以減少卵泡募集，但可以提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，從而提高妊娠率。李元等[18]對(duì)多囊卵巢綜合征患者在改良超長(zhǎng)方案中添加LH的研究結(jié)果顯示：促排卵第8天血清LH<0.5 U/L的多囊卵巢綜合征患者添加r-LH后，平均獲卵數(shù)明顯下降，著床率、妊娠率、抱嬰率等有增高趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，觀察組獲卵數(shù)下降，但臨床妊娠率有提高的趨勢(shì)，與Santi等[17]及李元等[18]的研究結(jié)果一致。Ruvolo等[19]對(duì)長(zhǎng)方案GnRH-a降調(diào)節(jié)的研究顯示，通過(guò)對(duì)取卵獲得的卵丘細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，刺激第8天起添加r-LH組比單純使用r-FSH促排卵組成熟卵母細(xì)胞增多，而且單用r-FSH組顆粒細(xì)胞凋亡率比添加r-LH組高。添加了r-LH的卵丘細(xì)胞在排卵前可以更好地支持胞核和胞漿成熟。Bosco等[20]證實(shí)人類(lèi)卵母細(xì)胞凋亡決定了ICSI后的受精失敗。如果卵母細(xì)胞的凋亡通過(guò)卵丘細(xì)胞的縫隙連接分子信號(hào)通路調(diào)節(jié)激活，卵丘細(xì)胞的低凋亡率將會(huì)預(yù)示優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞質(zhì)量，以及更好的受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率。Westergaard等[21]研究發(fā)現(xiàn)如果卵巢刺激第8天血清LH≤0.5 U/L，則流產(chǎn)率明顯增加(分別是45%和9%)。Fleming等[22]研究發(fā)現(xiàn)，若卵泡中期LH≤0.5 U/L，會(huì)出現(xiàn)HCG日E2水平降低，導(dǎo)致妊娠結(jié)局不良。李頌軍等[23]在一項(xiàng)改良超長(zhǎng)方案中添加r-LH的研究中發(fā)現(xiàn)，使用改良超長(zhǎng)方案降調(diào)節(jié)后，對(duì)于LH抑制較深者早期添加r-LH可獲得滿(mǎn)意的臨床結(jié)局，種植率及臨床妊娠率均顯著提高。目前認(rèn)為衡量垂體-卵巢軸降調(diào)節(jié)過(guò)度的標(biāo)準(zhǔn)為卵泡中期血清LH水平≤0.5 U/L。由此，在本研究中，對(duì)早卵泡期長(zhǎng)方案患者在卵巢刺激第8天進(jìn)行LH水平測(cè)定。觀察組中r-LH的及時(shí)添加，改善了卵母細(xì)胞質(zhì)量，MⅡ卵率增加，妊娠率相對(duì)較高，但未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能和樣本量較小及添加r-LH的劑量不足或者添加時(shí)間較短有關(guān)。

綜上，臨床控制性卵巢刺激藥物各種各樣，不同的藥物會(huì)使不同的患者獲益。對(duì)于早卵泡期長(zhǎng)方案的卵巢刺激過(guò)程中LH水平過(guò)度抑制(LH≤0.5 U/L)的患者，添加r-LH可能有利于改善IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局，F(xiàn)SH+r-LH促排卵方案有提高臨床妊娠率的趨勢(shì)。后續(xù)需要開(kāi)展更大樣本量的前瞻性研究以進(jìn)一步探討其對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響，并探索其個(gè)體化用藥的時(shí)間和劑量等。

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