蓋子璇　徐寶美

摘 要：[目的]研究不同條件對測定蛋白質濃度過程中影響。[方法]以分子伴侶GroEL為研究對象，利用蛋白質與考馬斯亮藍顯色原理， 測定蛋白質含量， 并對測定條件進行優(yōu)化。[實驗結果]：考馬斯亮藍和蛋白的復合物在595nm處有最大吸收，反應2～5min蛋白和染料結合恒定， 20℃孵育測量對實驗影響較小，蛋白質含量受SDS干擾。測定所用的標準曲線方為：y=0.0144x+0.0592 。[結論]本文從多方面探究了外界因素對其影響，發(fā)現(xiàn)采用考馬斯亮藍測定蛋白質濃度、時間、溫度、干擾劑等都是影響實驗結果準確性的重要因素。

關鍵詞：考馬斯亮藍法；蛋白質；GroEL；時間；溫度；干擾劑

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）04-0000-00

蛋白質是生命體的基本元素 [1-2]。據(jù)前人研究，組織和細胞的更新和修補，物質代謝，生理功能的調控以及能量供應都離不開蛋白質[2]。蛋白質正確折疊才能發(fā)揮功能，錯誤折疊就會導致廢棄蛋白質不斷積累，聚集，引起許多疾病，包括阿爾茲海默癥在內的若干種神經(jīng)退化疾病，對蛋白質進行研究尤為重要 [3]。一般而言，生物體內新生肽鏈的正確折疊需要分子伴侶的輔助，GroEL便是其中具有重要研究意義的分子伴侶 [4]。

蛋白質定量測定有諸多應用，例如科研研究、臨床檢驗、疾病診斷，準確定量對實驗研究至關重要[5-6]。目前，測定蛋白含量常用的方法有紫外吸收法、凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法、考馬斯亮藍法等[7-9]。1976 年 Bradford 發(fā)明了考馬斯亮藍法（ G250）[10 -12]?？捡R斯亮藍G-250染料和蛋白質結合，通過特征峰測定蛋白含量。同時，具有靈敏度高、測定快、簡便等優(yōu)點[11]。盡管考馬斯亮藍法有許多優(yōu)點，但也有許多因素影響結果的準確性。本文以分子伴侶GroEL為待測蛋白，研究顯示，溫度、時間、干擾劑等對蛋白質結構均有影響[13]，可為今后科研工作中測定蛋白質濃度準確性提供建議和指導。

1 實驗材料與儀器設備

（1）考馬斯亮藍G-250 購自天根生化科技有限公司。

（2）牛血清白蛋白標準液 購自天根生化科技有限公司。

（3）SDS（十二烷基硫酸鈉） 稱取SDS 10mg，蒸餾水定容至10ml。

（4）分子伴侶GroEL蛋白由實驗室制備并保存。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

取 10μL標準蛋白，140μL PBS， 2.85mL考馬斯亮藍G-250，混勻，測紫外吸收光譜， 結果如圖1，染料蛋白復合物在 595nm 處有特征吸收峰。

在該波長下測定蛋白復合物準確性會比較高。

2.2 時間對吸收度的影響

取25μL1mg/ml標準蛋白，125μL PBS緩沖液，2.85mL考馬斯亮藍G-250，混勻， 測時間掃描曲線， 結果如圖2所示，在 150～300s 范圍內，吸光度趨于恒定。

2.3 SDS 干擾實驗

（1）取6支5mLEP管，分別編號后按表 1～5 劑量依次加入標準蛋白、SDS、PBS和考馬斯亮藍試劑。見表1。

（2）混合均勻20min 后，測A595nm。

SDS，陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，還可使蛋白質分子中的二硫鍵還原，十二烷基部分是疏水結構，可插入蛋白質的疏水內部，這樣，SDS就破壞了蛋白的疏水作用，從而破壞蛋白的三級或四級結構，引起變性。

隨SDS量的增加，特征吸收值逐漸降低。加入SDS濃度為40～60uL時，混合液的595nm處的吸收峰急劇降低，呈直線下降趨勢，說明SDS對蛋白的破壞程度增大了。

2.4 標準曲線的制作

按表 2取樣。將溶液混合放置 2～5min后測量，記錄A595nm，見表1。

2.5 溫度對蛋白濃度的影響

取20μL1mg/ml標準蛋白，130μL PBS緩沖液， 2.85mL考馬斯亮藍G-250，混勻，放置10min后，分別于10℃，20℃，30℃孵育5min，10min，15min，20min，25min，30min測A595nm，結果如表3。

正常室溫下同條件測的A值為0.520，放置10min后，不同孵育條件下結果顯示：隨孵育時間的延長，吸光度均逐漸下降。溫度為10℃，與標準蛋白濃度比誤差百分比達到55%。當溫度為30℃，與標準蛋白濃度比誤差百分比也達到55%。當溫度為20℃，誤差最小。由此可見，高溫或低溫均會影響蛋白測定的濃度。20℃是考馬斯亮藍染料的最適溫度，在此條件下測定蛋白濃度表現(xiàn)出比較穩(wěn)定的結果，但孵育時間不可過長，短時間內結果比較穩(wěn)定.并與之前結果相符。

2.6 樣品分子伴侶GroEL蛋白的測定

取1μL樣品，149μLPBS緩沖液， 2.85mL考馬斯亮藍G-250混勻，放置 2～5min 后，測A595nm。0號試管作空白，見表4。

3結語

根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)：時間、溫度、干擾劑等對蛋白質濃度的測定有一定影響。根據(jù)時間影響實驗，反應2～5min蛋白復合物較穩(wěn)定。根據(jù)溫度變化實驗，可知不同溫度條件下，蛋白濃度測定值都會隨孵育時間的延長而逐漸降低。根據(jù)SDS干擾實驗，蛋白質含量測定隨SDS量的增加對蛋白影響越大。

綜上所述，時間、溫度、干擾劑等因素對考馬斯亮藍測定蛋白質濃度均有影響，要合理優(yōu)化測定方案，可進一步提高測定的精準度，為分子伴侶GroEL的后續(xù)研究奠定良好的基礎。

參考文獻

[1] 彭晶晶，等.蛋白質折疊的研究與應用進展[J]西安文理學院報（自然科學版），2011.14（1），5-7.

[2] 劉聰.活性肽-更高級別的蛋白質營養(yǎng)[J].中國食品報，2015.

[3] 唐兵.蛋白質的折疊[J].氨基酸和生物資源，1997，19（3）：51-54.

[4] 姚玲，等.GroEL的耗能分子伴侶機制[J].生物化學與生物物理進展，2015，42（2）154-160.

[5] 蔣英芝，賀連華，劉建軍.蛋白質功能研究方法及技術[J].生物技術通報，2009（9）：38-43.

[6] 趙卓，等.溫度對考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的影響[J]安徽農業(yè)科學，2015，43（4）5-7.

[7] 李寧.幾種蛋白質測定方法的比較[J].山西農業(yè)大學學報（自然科學版），2006，2：132～134.

[8] 王芳，包怡紅，于震.食品中蛋白質快速檢測技術的研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（ 11）：372-375.

[9] 楊玉芳.蛋白質含量測定方法[J].明膠科學與技術，2007，27（2）：98-101.

[10] 許淑芳，朱江，劉鄰渭.考馬斯亮蘭G-250法測定蘋果濃縮汁生產中的蛋白含量[J].飲料工業(yè)，2005，8（1）：45-48.

[11] 趙英勇，戴云，崔秀明，等.考馬斯亮藍G-250法測定草烏中可溶性蛋白質含量[J].云南民族大學學報，2006，15（3）：235-237.

[12] 馮昕，王吉中，堯俊英，等.考馬斯亮藍法測定乳與乳制品中蛋白質的含量[J].糧食與食品工業(yè)，2010，17（3）：57-59.

[13]陳麗娜，王倩，尚玉奎，等.人類蛋白質結構互作網(wǎng)絡—結構域網(wǎng)絡拓撲與蛋白質功能的影響[J].生物化學與生物物理進展，2010，37（5）：517-526.

作者簡介：蓋子璇，女，山東威海人。