王明陽，王光磊，陳新亮，張 燚，龍 淼

(沈陽農業(yè)大學 畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866)

1993年Lee在研究線蟲的發(fā)育時發(fā)現(xiàn)了第1個調控發(fā)育的基因lin-4，隨后又在線蟲發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)分子let-7，從此打開了人們對于miRNA的研究大門[1]。在之后的研究中人們認識到miRNA是一種高度保守的小分子。miRNA在生物體內不參與蛋白質的合成，但是在編碼蛋白的基因表達方面有著非常重要的調控作用。miRNA在細胞核中在DNA聚合酶2作用下由編碼的miRNA基因轉錄成miRNA的前體pre-miRNA，再由細胞核內的RNase3-Drosha酶經加工剪切為70個核苷酸，類似發(fā)夾結構的pre-miRNA。pre-miRNA在核轉運蛋白Exportin5的作用下，從細胞核內運輸?shù)郊毎|中，在細胞質中在RNase3-Dicer酶的作用下，pre-miRNA被剪成雙鏈的miRNA，成熟的miRNA與其互補的序列結合成雙螺旋結構，隨后雙螺旋解旋，其中一條與RNA誘導沉默復合物RISC結合，識別靶mRNA并阻止其翻譯[2]。

1 miRNA的生物學功能

miRNA作為一種特殊的遺傳物質，成為當今學術界研究的熱點。對miRNA的研究正在不斷增加，原因是科學家認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。在線蟲、果蠅、小鼠和人等物種中已經發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個miRNA中的多數(shù)具有和其他參與調控基因表達的分子一樣的特征——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性，提示miRNA有可能作為參與調控基因表達的分子，因而具有重要意義。

1.1 哺乳動物中的miRNA通過對蛋白質編碼基因來影響mRNA對蛋白質的翻譯

用核糖體分析來測量miRNA對蛋白質產生的總體影響，并將其與同時測量的mRNA水平的影響進行比較。 對于異位和內源性miRNA調節(jié)相互作用，蛋白質生產減少的84%是由于mRNA的降低引起的[3]。 表明mRNA水平的變化反映了miRNA對基因表達的影響，并表明目標mRNA的不穩(wěn)定性是蛋白質含量降低的主要原因。這反映了哺乳動物miRNA主要用于降低靶mRNA水平，使miRNA對蛋白的翻譯產生了影響。

1.2 miRNA對肌肉發(fā)育的調節(jié)作用

Wang Y H等[4]對山羊骨骼肌的兩個發(fā)育階段(胎兒階段和6月齡階段)miRNA的表達譜進行了綜合研究，從胎山羊文庫(FC)和6月齡山羊文庫(SMC)分別獲得了15 627 457和15 593 721個miRNA，鑒定了464種已知miRNA和83種新型miRNA候選物，通過比較miRNA譜，鑒定出336個差異表達的miRNA，然后預測差異表達的miRNA的潛在靶標。為了了解肌肉發(fā)育過程中miRNA的調控網(wǎng)絡，對兩個發(fā)育階段的mRNA表達譜進行了分析，確定了7 322個差異表達基因(DEGs)。然后將miRNA的潛在靶標與DEGs進行比較，篩選出2個基因組的交叉點，稱為差異表達靶標(DE-靶標)，其涉及231個途徑。具有最小P值的231個途徑中的10個顯示為網(wǎng)絡通路?；谕泛途W(wǎng)絡的分析，研究發(fā)現(xiàn)miR-424-5p和miR-29a可能對肌肉發(fā)育具有重要的調控作用，需要進一步研究。這項研究闡明miRNA和mRNA之間的復雜調控網(wǎng)絡以及miRNA對肌肉發(fā)育的作用。

2 miRNA靶基因的確定

盡管數(shù)百種miRNA在最近幾年中被發(fā)現(xiàn)，但是只有非常少量的miRNA被確定其作用，許多其他miRNA的作用還沒有被闡明。因此,發(fā)現(xiàn)miRNA的作用靶點成為了解其在不同的生理過程中的功能的關鍵。

2.1 基因芯片法

將miRNA成熟體雙鏈或腺病毒載體轉染至細胞中，使得miRNA在細胞中表達提高，之后利用基因芯片分析mRNA的變化，以找出相應miRNA的靶基因。由于miRNA在體內通過翻譯抑制或影響mRNA的穩(wěn)定性起作用，因此這種方法在尋找翻譯抑制作用的miRNA的靶基因時存在一定困難。

2.2免疫共沉淀法

利用AGO蛋白家族既能結合miRNA又能結合mRNA的特性，分別使用AGO-1和AGO-2蛋白的單克隆抗體在人類細胞中進行免疫共沉淀，得到與AGO-1和AGO-2蛋白結合的mRNA條帶，并通過克隆測序對這些mRNA進行鑒定。同時從與AGO-1蛋白結合的mRNA中隨機挑選幾條進行熒光素酶報告基因檢測,鑒定哪條是miRNA的靶基因[5]。

2.3 細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記技術

細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記技術(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)是指在細胞培養(yǎng)過程中利用穩(wěn)定同位素標記的氨基酸結合質譜技術，對蛋白表達進行定量分析的一種新技術。它不僅可以對蛋白質進行定性分析，還可以通過質譜圖上輕重穩(wěn)定同位素峰的比例來反映對應蛋白在不同狀態(tài)下的表達水平，實現(xiàn)對蛋白的精確定量[6]。

2.4 miRNA靶基因的鑒定

目前最為常用的miRNA靶位點鑒定方法是熒光素酶報告基因法[7]。其基本原理是首先構建熒光素酶表達載體，將希望鑒定的miRNA靶基因的3′UTR構建到熒光素酶基因的3′UTR中，之后將構建好的載體轉染細胞并改變細胞中相應miRNA的表達水平，最后檢測熒光素酶的表達情況以分析轉染3′UTR中是否含有miRNA的靶位點。該方法因為是對熒光信號進行檢測，因而檢測的準確率較高。

3 miRNA在腫瘤方面的應用

miRNA在生物的生命過程和疾病發(fā)生過程中扮演著十分重要的角色[8]。其中尤其與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關系十分密切。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中miRNA常作為腫瘤臨床診斷的標志物[9]。而越來越多的研究表明，miRNA作為原癌基因和抑癌基因也為臨床癌癥的診療提供了一個新思路。

3.1 miRNA在腫瘤診斷方面的應用

傳統(tǒng)的惡性腫瘤確診方法是通過外科手術方法在腫瘤處取樣做石蠟切片，這種診斷方式十分繁瑣。目前有研究表明，癌癥患者體內miRNA表達差異顯著。miRNA有希望成為癌癥治療中的新靶標和工具。有報道指出，在胃癌細胞系MKN-45的SP細胞內有關鍵miRNA，包括hsa-miR-3175、hsa-miR-203、hsa-miR-130a、hsa-miR-324-5p、hsa-miR -34a和hsa-miR-25-star。這些關鍵的miRNA可通過進一步研究作為胃癌診斷的標志物[10]。研究認為，通過分析黑色素瘤患者的血清的754個miRNA,結果表明miR-146a在UM患者血清以及血清外顯子中均有上調。在福爾馬林固定的石蠟包埋的UM中也檢測到miR-21和miR-146a的上調，因此miR-146a可以被認為是UM的潛在循環(huán)標志物[11]。通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)在29例良性前列腺增生(BPH)患者和215例前列腺癌患者的無細胞尿液樣品中92種miRNA的表達水平的分析，發(fā)現(xiàn)了2組新的miRNA生物標志物。這些發(fā)現(xiàn)是否可以準確預測前列腺癌的存在和前列腺切除術后復發(fā)的可能性，需要進一步的臨床試驗。但這一發(fā)現(xiàn)為前列腺癌的臨床診斷提供了新思路[12]。逆轉錄-實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測了40個對照受試者，187個早期乳腺癌患者和45個轉移性乳腺癌患者的miRNA水平，發(fā)現(xiàn)miR-1280，miR-1260和miR-720在乳腺癌患者血液中上調，miR-1280水平在乳腺癌患者中顯著增加。在37例轉移性乳腺癌患者中，miR-1280水平顯著降低。所以,miR-1280不是原始的miRNA，而是tRNA Leu衍生的片段。表明循環(huán)的tRNA衍生的miRNA，miR-1280在乳腺癌患者中的不同表達，可能作為ER陽性乳腺癌的生物標志物[13]。這也為乳腺癌的診斷提供了新思路。

3.2 miRNA在腫瘤治療方面的應用

當代醫(yī)學對腫瘤的治療通常采用外科手術切除癌變的組織或器官，之后采取放療、化療的方法殺死癌細胞防止擴散。外科手術可以清除病變的組織和器官，但無法完全清除體內的癌細胞，所以需要后續(xù)的放療和化療。但放療和化療不僅殺死癌細胞，也破壞了健康的組織和器官，所以尋找一種安全有效的可代替放療、化療的方法變得十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，miR-503在晚期前列腺癌組織和細胞系中顯著下調，miR-503的下調與侵襲性臨床病理特征和前列腺癌患者預后不良密切相關。表明miR-503在前列腺癌治療中的潛在應用[14]。miR-134-3p的表達在人卵巢癌干細胞(OCSCs)和CD44- / CD133-卵巢癌中顯著變化。miR-134-3p在人類OCSCs中的過表達不僅可以抑制RAB27A的表達，而且可以有效地下調一些腫瘤增殖和侵襲基因的表達。 miR-134-3p的過度表達不僅可以抑制人類OCSCs的體外增殖和細胞周期進程，而且可以降低裸鼠的致瘤性[15]。在肝癌患者血清和肝癌細胞系中觀察到miR-200a的表達水平降低，miR-200a在肝癌細胞系中的過表達降低了細胞增殖、遷移和侵襲。轉錄因子Foxa被鑒定為miR-200a的新靶標，并在miR-200a過表達的細胞中mRNA和蛋白質水平下調。同時，F(xiàn)oxa2的恢復顯著抑制了miR-200a的腫瘤抑制作用。這表明miR-200a通過靶向Foxa2調節(jié)肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，表明miR-200a可能作為肝癌診斷和治療的潛在分子[16]。 miR-520e通過直接靶向Zbtb7a的3'非翻譯區(qū)(UTR)并因此降低Zbtb7a蛋白水平，顯著調節(jié)NSCLC細胞生長，細胞侵襲和細胞遷移。 miR-520e對非小細胞肺癌進展的這些影響可以通過Zbtb7a在A549細胞中的過表達來說明。 此外，miR-520e水平和Zbtb7a水平均與非小細胞肺癌細胞中的Wnt信號傳導相關。 這些結果表明，過表達的miR-520e調節(jié)非小細胞肺癌細胞生長、侵襲和遷移是通過靶向調節(jié)Zbtb7a在Wnt信號通路的傳導來產生作用的，說明miRNA-520e通過靶向Zbtb7a介導的Wnt信號通路抑制非小細胞肺癌細胞生長[17]。采用RT-qPCR技術檢測70例HCC和相應腫瘤相鄰組織中miR-577的相對表達，用卡方檢驗分析miR-577表達及臨床特征。將miR-577質粒轉染HepG2細胞;通過流式細胞術檢測細胞周期，通過MTT法和BrdU法檢測細胞增殖，流式細胞術和caspase3/7活性分析檢測細胞凋亡。通過免疫組織化學測定β-catenin的表達。 Spearman相關分析用于分析miR-577和β-catenin之間的關系。RT-qPCR和Western blot檢測轉染HepG2細胞中β-catenin的表達。結果發(fā)現(xiàn)與正常腫瘤相鄰組織相比，肝癌組織中miR-577的相對表達顯著降低。 miR-577的低表達與腫瘤大小和晚期腫瘤淋巴結轉移階段顯著相關。 miR-577質粒的轉染可抑制細胞增殖，增強細胞凋亡，阻斷G0/G1期細胞周期。 HCC組miR-577與β-catenin的下游靶標表達呈顯著負相關。轉染后HepG2細胞mRNA和蛋白表達下調。說明miR-577的低表達與HCC組織惡性臨床病理特征有關，miR-577可通過下調β-catenin抑制HCC的生長[18]。研究發(fā)現(xiàn)miR-146a與相應的正常組織相比，在宮頸癌(CaCx)中表現(xiàn)出高表達，但結直腸癌(CRC)表達相對較低。然而，miR-146a的異位表達抑制宮頸癌(CaCx)和結直腸癌(CRC)細胞的增殖，并抑制其遷移和侵襲。當內源性miR-146a的表達被抑制時，宮頸癌(CaCx)和結直腸癌(CRC)細胞的增殖，遷移和侵襲能力增加，表明miR-146a具有抗腫瘤發(fā)生功能。 miR-146a的重新表達下調關鍵信號轉導中間體的表達，即CTNNB1、STAT3、RELA、CCND1和SNAI1，增強TP53和CDH1表達。這說明miR-146a為人宮頸癌和大腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制提供了依據(jù)[19]。這些都表明miRNA可能成為癌癥治療的新方法。

3.3 miRNA在腫瘤預后方面的應用

腫瘤的預后是當今醫(yī)學的一大難題，但是大量研究表明癌癥的發(fā)生與體內miRNA的表達水平有著十分密切的關系。研究發(fā)現(xiàn)miR-148靶向的39個非翻譯區(qū)中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)可以改變其結合強度，影響癌癥的易感性和預后[20]。miR-22和TIAM1可能在結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮調節(jié)作用，低miR-22水平與結直腸癌患者預后不良有關[21]。miR-330-5p可用于食管癌腺癌新輔助放化療敏感性的調節(jié)[22]，miR-33a抑制上皮-間質轉化和轉移，可能是非小細胞肺癌的預后指標[23]，表明miRNA可作為癌癥預后的生物學標志。

4 結語

研究發(fā)現(xiàn)的大量miRNA在細胞的早期發(fā)育、分化、更新、基因的調節(jié)和表達、以及腫瘤的發(fā)生和轉移都有十分密切的關系，但許多miRNA與靶基因的作用機理，以及miRNA對下游靶基因的識別和鑒定都沒有詳細的闡述。而miRNA在病理中的作用，尤其是miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的詳細的機理沒有明確的闡述，這些將成為今后研究的重點。相信隨著對于miRNA研究的深入，miRNA將會越來越多的應用于基因的調控與表達，病理機理的闡述，藥物作用的分析，人們對于miRNA的應用也會越來越廣泛。

[1] 杜秋麗.miRNA及其功能研究[J].生物學通報，2004,39(4):13.

[2] 張 航,劉 威,劉建軍.microRNA的功能及其臨床應用[J].生物技術通訊，2015,26(2):278.

[3] Guo H,Ingolia N T,Weissman J S,et al.Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels[J].Nature,2010,466(7308):835-840.

[4] Wang Y H,Zhang C L,Fang X T,et al.Identification and profiling of microRNAs and their target genes from developing caprine skeletal muscle[J].PLoS One,2014，9(5):e96857.

[5] Wen J,Parker B J,Jacobsen A,et al.MicroRNA transfection and AGO-bound CLIP-seq data sets reveal distinct determinants of miRNA action[J].RNA,2011,17(5):820-834.

[6] Mihailovich M,Bonaldi T.MS-analysis of SILAC-labeled MYC-driven B lymphoma cells overexpressing miR-17-19b[J].Data in Brief,2016,7:349-353.

[7] Nicolas F E.Experimental validation of microRNA targets using a luciferase reporter system[J].Meth Mol Biol,2011,732:139-152.

[8] Reddy K B.MicroRNA (miRNA) in cancer[J].Cancer Cell Int,2015,15(1):38

[9] Abba M L,Patil N,Leupold J R H,et al.MicroRNAs as novel targets and tools in cancer therapy[J].Cancer Lett,2017,387:84-94.

[10] Zhang H.Primary analysis and screening of microRNAs in gastric cancer side population cells[J].World J Gastroenterol,2015,21(12):3519.

[11] Ragusa M,Barbagallo C,Statello L,et al.miRNA profiling in vitreous humor,vitreal exosomes and serum from uveal melanoma patients:Pathological and diagnostic implications[J].Cancer Biol Ther,2015,16(9):1387-1396.

[12] Freds E J,Rasmussen A K I,Thomsen A R,et al.Diagnostic and prognostic microRNA biomarkers for prostate cancer in cell-free urine[J].Eur Urol Focus,2017,9:1-6

[13] Park I H,Kang J H,Lee K S,et al.Identification and clinical implications of circulating microRNAs for estrogen receptor-positive breast cancer[J].Tumor Biol,2014,35(12):12173-12180.

[14] Jiang X,Chen Y,Du E,et al.GATA3-driven expression of miR-503 inhibits prostate cancer progression by repressing ZNF217 expression[J].Cellular Signalling,2016,28(9):1216-1224.

[15] Chang C,Liu T,Huang Y,et al.MicroRNA-134-3p is a novel potential inhibitor of human ovarian cancer stem cells by targeting RAB27A[J].Gene,2017,605:99-107.

[16] Chen S,Ma D,Chen Q,et al.MicroRNA-200a inhibits cell growth and metastasis by targeting Foxa2 in hepatocellular carcinoma[J].J Cancer,2017,8(4):617-625.

[17] Zhang Z J.MicroRNA-520e suppresses non-small-cell lung cancer cell growth by targeting Zbtb7a-mediated Wnt signaling pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,486(1):49-56.

[18] Wang L Y,Li B,Jiang H H,et al.Inhibition effect of miR-577 on hepatocellular carcinoma cell growth via targeting b-catenin[J].Asian Pacific J Trop Med,2015,8(11):923-929

[19] Sathyanarayanan A,Chandrasekaran K S,Karunagaran D.microRNA-146a inhibits proliferation,migration and invasion of human cervical and colorectal cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,480(4):528-533.

[20] Song P,Zhu H,Zhang D,et al.A genetic variant of miR-148a binding site in the SCRN1 3′-UTR is associated with susceptibility and prognosis of gastric cancer[J].Sci Reports,2015,4(1):7080.

[21] Li B,Li B,Sun H,et al.The predicted target gene validation,function,and prognosis studies of miRNA-22 in colorectal cancer tissue[J].Tumor Biol,2017,39(3):568836471.

[22] Bibby B A S,Reynolds J V,Maher S G.MicroRNA-330-5p as a putative modulator of neoadjuvant chemoradiotherapy sensitivity in oesophageal adenocarcinoma[J].PLoS One,2015,10(7):e134180.

[23] Yang L,Yang J,Li J,et al.MircoRNA-33a inhibits epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis and could be a prognostic marker in non-small cell lung cancer[J].Sci Reports,2015,5(1):13677.