陸彥，溫炎佳，牛志強(qiáng)，王雨，李新國(guó)＊＊

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物類(lèi)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 北京 102206；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 北京 100070；3.焦作市農(nóng)經(jīng)管理站 河南焦作 454002）

牧樂(lè)星主要成分為酒石酸泰萬(wàn)菌素，屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)動(dòng)物專(zhuān)用抗生素（圖1），該品對(duì)支原體有特效。其作用機(jī)理主要通過(guò)阻礙菌體蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮滅菌作用；對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌有抗菌活性。雞毒支原體病也稱(chēng)雞慢性呼吸道?。–hronic Respiratory Disease，CRD），是由雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）引起的一種接觸性、傳染性呼吸道疾病，可以通過(guò)水平傳播和垂直傳播，疾病發(fā)展緩慢，病程長(zhǎng)，有的呈隱性感染，臨床上以咳嗽、流鼻涕、呼吸發(fā)出啰音、竇部腫脹、呼吸困難或張口呼吸等為特征長(zhǎng)期在雞群中蔓延。雞毒支原體感染發(fā)病率極高，幾乎100%的雞場(chǎng)都有此病發(fā)生，雞群最高感染率達(dá)83.4%，可造成幼雛淘汰率上升和成年母雞產(chǎn)蛋率下降，是造成養(yǎng)雞業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一。

對(duì)于這種疫病，目前國(guó)內(nèi)外多以抗菌藥物治療為主。牧樂(lè)星（主要成分泰萬(wàn)菌素）具有高效、低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，并且不會(huì)產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素之間的交叉耐藥，是一種較好的治療呼吸道和消化道感染的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。有文獻(xiàn)報(bào)道，以推薦劑量口服給藥后，泰萬(wàn)菌素在豬體內(nèi)能夠被快速吸收，在雞體內(nèi)約1h 達(dá)到血漿峰濃度，能夠快速地分布到主要器官，其中膽汁、脾臟、肺臟、腎臟和肝臟中的濃度最高；泰萬(wàn)菌素代謝較快，30min內(nèi)約有50%的原藥被代謝，主要代謝物為3-O-acetyltylosin（3-AT）；泰萬(wàn)菌素在豬體內(nèi)排泄較快，主要的消除途徑為糞便排出，給藥后72h，使用HPLC 方法檢測(cè)，泰萬(wàn)菌素的含量已低于10%。汪明等對(duì)泰萬(wàn)菌素可溶性粉劑在雞毒支原體上的療效展開(kāi)研究，試驗(yàn)結(jié)果表明泰萬(wàn)菌素對(duì)用雞毒支原體誘發(fā)雞呼吸道疾病有良好的預(yù)防和治療作用，當(dāng)飲水給藥濃度達(dá)到125μg/m L 時(shí)，預(yù)防組和治療組均能明顯減少感染雞的失重，大幅度降低氣囊的病理?yè)p傷，提高感染雞的存活率，當(dāng)治療組飲水給藥濃度達(dá)到250μg/m L 時(shí)，己完全不見(jiàn)氣囊損傷,對(duì)照組中泰樂(lè)菌素飲水濃度達(dá)500μg/m L 時(shí)才表現(xiàn)出一定控制雞呼吸道癥狀療效，該試驗(yàn)表明泰萬(wàn)菌素對(duì)雞源雞毒支原體有極好的療效。本試驗(yàn)采用ELISA 方法測(cè)定草種雞雞毒支原體的抗體，通過(guò)草種雞血清中支原體抗體水平變化和支原體抗體陽(yáng)性率來(lái)評(píng)價(jià)牧樂(lè)星藥物對(duì)雞毒支原體控制情況。從試驗(yàn)設(shè)計(jì)和原理上分析，牧樂(lè)星對(duì)支原體有很強(qiáng)的殺滅作用，結(jié)果對(duì)牧樂(lè)星藥物治療草種雞雞毒支原體有一定的參考價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)藥物

牧樂(lè)星（25%），由內(nèi)蒙古中牧生物藥業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

某私人種雞場(chǎng)，117 日齡草種雞，2 棟同日齡雞舍，3,000 只/棟，一棟作為試驗(yàn)組，另一棟作為對(duì)照組（表1）。

1.3 血清樣品的采集

對(duì)照組與試驗(yàn)組同時(shí)分別于給藥前、停藥第1d（給藥7d 后）、停藥第7d（給藥14d 后）、停藥第14d（給藥21d 后）、停藥第21d（給藥28d 后），共5 批各組隨機(jī)抽取30 只草種雞（母雞），經(jīng)翅靜脈采血2mL/只，于4℃冷藏析出血清后分離至離心管，血清凍存待檢。

1.4 試驗(yàn)材料及設(shè)備

M G 抗 原（E L I S A）：Biostone Animal Health LLC；MG 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：201101；MG 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：207401；試驗(yàn)儀器：待檢血清，酶標(biāo)板，移液器，采血管，離心管，槍頭等；酶標(biāo)儀：BIORED-680；生化培養(yǎng)箱：BSP-150

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 試劑盒采用間接ELISA方法 在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被雞毒支原體抗原。在試驗(yàn)中，加入稀釋后的待檢血清，經(jīng)過(guò)溫育后，若樣品中含有雞毒支原體特異性抗體，則與包被板上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再加入酶標(biāo)二抗，與檢測(cè)板上的抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物；在微孔中加入TMB 底物液，經(jīng)酶催化形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀450nm 波長(zhǎng)測(cè)定反應(yīng)孔中的吸光度值。顯色深度與樣品中的抗體含量成正相關(guān)。

1.5.2 試劑盒規(guī)格及組分

圖1 泰萬(wàn)菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 試驗(yàn)分組

表2 ELISA 檢測(cè)試劑組分

1.5.3 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果判定 判定標(biāo)準(zhǔn)：顯色深度（OD 值）與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為99.78%，因此采用樣品的OD 值大小表示樣品血清中雞毒支原體抗體水平的高低；根據(jù)樣品OD 值，樣品血清與陰性血清吸光度值之比P/N 值≥2 判定為陽(yáng)性，計(jì)算不同批次的雞毒支原體抗體陽(yáng)性率。經(jīng)ELISA 方法檢測(cè)給藥前測(cè)試組與對(duì)照組OD 值差異較小，表明給藥前測(cè)試組與對(duì)照組來(lái)源場(chǎng)所雞毒支原體抗體水平基本一致，具備對(duì)照參考的依據(jù)，下一步進(jìn)行給藥后的樣品測(cè)試。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 各個(gè)采樣點(diǎn)對(duì)照組與試驗(yàn)組檢測(cè)結(jié)果

在試驗(yàn)過(guò)程中OD 值偏高，體現(xiàn)出樣品的抗體水平比較高，其結(jié)果采用各組30 個(gè)樣品OD 總值進(jìn)行比較分析。結(jié)果見(jiàn)表3 和圖2，以上結(jié)果表明，停藥后第1d 與停藥后第7d 試驗(yàn)組相比對(duì)照組雞毒支原體抗體水平下降明顯；停藥后第14d 試驗(yàn)組相比對(duì)照組雞毒支原體抗體水平略有下降，但不明顯；停藥后第21d 試驗(yàn)組相比對(duì)照組雞毒支原體抗體水平恢復(fù)沒(méi)有明顯的變化。表明給藥后雞毒支原體抗體水平先降低后逐漸恢復(fù)，反映出藥物對(duì)雞毒支原體的控制在停藥后第14d 后由強(qiáng)轉(zhuǎn)弱。

2.2 試驗(yàn)組給藥前后抗體水平及陽(yáng)性率分析

為了重復(fù)驗(yàn)證上述試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在上述試驗(yàn)OD 值過(guò)高的基礎(chǔ)上，降低了包被原的濃度（從200X 降至2000X），降低了樣品濃度（由200X 降至800X），對(duì)試驗(yàn)組各組血清又進(jìn)行了同批試驗(yàn)（表4）。

為了更直觀(guān)地看到給藥前后五批樣品OD 值和陽(yáng)性率的變化（表5），將數(shù)據(jù)分析做圖來(lái)表示（圖3和圖4）。從圖3 結(jié)果分析后看出，OD 值的曲線(xiàn)呈V 型，就是停藥后第1d 到停藥后第7d，OD 值在不斷降低；停藥后第14d 到停藥后第21d，OD 值逐步回升。表明給藥后雞毒支原體抗體水平在給藥前兩周在降低，后兩周升高趨向于未給藥的正常水平。同時(shí)驗(yàn)證了前述的縱向?qū)Ρ鹊贸龅慕Y(jié)果。

圖2 試驗(yàn)停藥后第1d 到第21d 的變化

表3 對(duì)照組與試驗(yàn)組雞毒支原體抗體水平比較

表4 給藥前后試驗(yàn)組樣品吸光度值（OD 值）比較

從圖4 可以明顯看到，給藥前后五批樣品的抗體陽(yáng)性率趨勢(shì)呈U型，變化接近于OD 值曲線(xiàn)的變化，也是前兩周在不斷降低，后兩周恢復(fù)至未給藥的正常水平，表明藥物對(duì)雞毒支原體在前兩周有良好的控制率。

3 試驗(yàn)結(jié)論

1）給藥后測(cè)試組樣品的雞毒支原體抗體水平在1～14d 呈現(xiàn)下降狀態(tài)，15～28d 逐漸恢復(fù)至正常水平。

2）給藥后測(cè)試組樣品的雞毒支原體抗體陽(yáng)性率與抗體水平趨勢(shì)表現(xiàn)一致，牧樂(lè)星對(duì)草種雞雞毒支原體抗體陽(yáng)性率在給藥后兩周表現(xiàn)出明顯的抑制，從第三周起雞毒支原體抗體陽(yáng)性率逐漸增高。

3）根據(jù)本試驗(yàn)草種雞養(yǎng)殖條件及雞毒支原體抗體檢測(cè)結(jié)果，建議其用藥方法為：按泰萬(wàn)菌素計(jì)250ppm 濃度集中飲水給藥7d，停藥14d，為1 個(gè)療程，如果雞毒支原體控制無(wú)改善，可考慮再給藥1個(gè)療程。

4 討論

本試驗(yàn)采用ELISA 方法測(cè)定草種雞雞毒支原體的抗體，通過(guò)草種雞血清中支原體抗體水平變化和支原體抗體陽(yáng)性率來(lái)評(píng)價(jià)牧樂(lè)星藥物對(duì)雞毒支原體控制情況。從試驗(yàn)設(shè)計(jì)和原理上分析，牧樂(lè)星對(duì)支原體有很強(qiáng)的殺滅作用，最好的評(píng)價(jià)方法是檢測(cè)雞的支原體攜帶情況，由于分離支原體抗原存在技術(shù)上和數(shù)量上的難度，本試驗(yàn)選擇檢測(cè)支原體抗體水平以及陽(yáng)性率來(lái)間接反映藥物的作用。這種評(píng)價(jià)方法可能會(huì)受到抗原水平和抗體水平相關(guān)性的影響，有一些滯后性，但本試驗(yàn)得出的結(jié)果也能反映出一定的趨勢(shì)。因此本試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)牧樂(lè)星藥物治療草種雞雞毒支原體有一定的參考價(jià)值。

表5 試驗(yàn)組雞毒支原體抗體水平與陽(yáng)性率

圖3 試驗(yàn)組抗體水平比較

圖4 給藥前后樣品雞毒支原體抗體陽(yáng)性率

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于江蘇某私人草種雞場(chǎng)，養(yǎng)殖條件較差，對(duì)照組與試驗(yàn)組選擇2 棟同日齡且距離相近的雞舍，3,000 只/棟。采集的血清樣品中雞毒支原體抗體經(jīng)ELISA 方法檢測(cè)陽(yáng)性水平很高，給藥前測(cè)試組與對(duì)照組血清稀釋200 倍后陽(yáng)性率100%，經(jīng)過(guò)血清稀釋800 倍后陽(yáng)性率為60%，表明本試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源場(chǎng)所雞毒支原體的攜帶率及血清抗體水平非常高，可能動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境較差，隔代消毒不完全，造成雞群與環(huán)境中雞毒支原體的廣泛傳播與反復(fù)感染。

在雞血的采集和樣品保存方面，為了保證待測(cè)血清充足，本試驗(yàn)盡量采集2m L 以上的全血，在實(shí)驗(yàn)室離心后得到100μL 以上的血清用于檢測(cè)以及重復(fù)驗(yàn)證；但由于運(yùn)送路途比較遠(yuǎn)，加上保存時(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)，每批樣品總會(huì)有幾個(gè)血樣完全凝固，造成采集血清困難，可能對(duì)提取血清的抗體水平會(huì)有一定的影響。

本試驗(yàn)的試劑和溶液配制時(shí)間不應(yīng)該過(guò)長(zhǎng)，比如牛清蛋白溶液時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)有絮狀沉淀，在封閉完了后可能會(huì)難以洗干凈而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成誤差；硫酸濃度不能太高，否則在終止一段時(shí)間后測(cè)出OD 值偏小，所以終止后應(yīng)該盡快測(cè)出OD 值。

5 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)草種雞血清中支原體抗體水平變化和支原體抗體陽(yáng)性率來(lái)評(píng)價(jià)牧樂(lè)星藥物對(duì)雞毒支原體控制情況。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出牧樂(lè)星具有良好的防治效果，未見(jiàn)不良反應(yīng)，是一種較好的治療雞毒支原體感染的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素?！?/p>