何平有 ,劉 濤 ,楊保收 ,林 建 ,鄒立宏 ,邱貞娜 ,郁宏偉 、2,趙玉龍 ,劉 浩
(1.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司,071000;2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司,300308;3.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,100097)
鴨坦布蘇病毒病(DTMUV)是鴨坦布蘇病毒病的病原,引起不同日齡的北京鴨、櫻桃谷鴨、金定鴨和麻鴨等發(fā)病,主要表現(xiàn)為精神沉郁、產(chǎn)蛋下降和死淘率增加,給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。在DTMUV的疫苗研究中,近年來有利用禽胚及其成纖維細(xì)胞、傳代細(xì)胞等培養(yǎng)病毒的報(bào)道[1],但受病毒株系差別、培養(yǎng)體系等因素影響,其增殖條件和疫苗效果差異比較大。筆者為提高DTMUV HB株疫苗的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì),對(duì)HB株細(xì)胞適應(yīng)毒在鴨胚成纖維細(xì)胞上的增殖條件進(jìn)行篩選,擬確定該疫苗的最佳生產(chǎn)工藝。
鴨坦布蘇病毒HB株F4代細(xì)胞適應(yīng)毒由瑞普公司質(zhì)量管理部提供。
購(gòu)自河北省未感染坦布蘇病毒健康鴨群所產(chǎn)種蛋,自行孵化至適宜日齡備用,制成成纖維單層細(xì)胞。
DMEM培養(yǎng)基和新生牛血清均購(gòu)自Gibco公司。
分別按0.25%、0.5%、1.0%和2.0%的比例將毒種接入致密鴨胚成纖維單層細(xì)胞,每個(gè)比例接種3瓶,補(bǔ)加含2%新生牛血清的DMEM液,置37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日觀察細(xì)胞病變(CPE),當(dāng)CPE達(dá)到75%~80%時(shí)收獲病毒懸液。將收獲的病毒液分別取3個(gè)適宜的稀釋度按中國(guó)獸藥典方法測(cè)定其病毒含量[2]。
按2.1優(yōu)選的接毒比例分別接種鴨胚成纖維單層數(shù)瓶,于接毒后72、78、84、90和96h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取出2瓶,重復(fù)3次。按2.1的方法測(cè)定病毒含量。
結(jié)果詳見表1。由表1可見,4個(gè)接毒比例以0.5%接毒比例收獲的病毒液病毒含量最高,均不低于106.7TCID50/0.1m l,1%接毒比例次之,0.25%和2%接比例量最差。因此,最佳接毒比例為0.5%。
結(jié)果詳見表2。由表2可見,隨著收獲時(shí)間的延長(zhǎng),收獲病毒液的病毒含量呈一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì);其中接毒后84小時(shí)病毒含量最高,三批次毒液病毒含量均不低于107.1TCID50/0.1m l;其次是接毒后78h收獲的病毒液,三批次病毒含量在106.5~106.9TCID50/0.1m l。
本研究成功實(shí)現(xiàn)鴨坦布蘇病毒培養(yǎng)從組織培養(yǎng)向細(xì)胞培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變,在實(shí)驗(yàn)室前期細(xì)胞適應(yīng)株DTMUV HB株的基礎(chǔ)上,對(duì)不同接毒比例和收獲時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,為進(jìn)一步完善該疫苗株的生產(chǎn)工藝提供技術(shù)支持。
從不同接毒比例看,當(dāng)接毒比例從0.25%提升至0.5%時(shí)收獲病毒液的病毒含量,從105.9~106.1TCID50/0.1ml提升到106.7TCID50/0.1ml以上,而后隨著接毒比例上升,出現(xiàn)病毒含量下降。因此,接毒比例并不是簡(jiǎn)單的越高越好,它們之間存在一個(gè)最適合的比例,本研究的最佳接毒比例為0.5%。
從不同收獲時(shí)間看,當(dāng)收獲時(shí)間從接毒后72小時(shí)至84小時(shí),收獲毒液的病毒含量從106.1~106.3TCID50/0.1ml提升到107.1TCID50/0.1ml以上,而后隨著收獲時(shí)間延長(zhǎng),出現(xiàn)病毒含量下降的情況。這可能與鴨坦布蘇病毒的特性相關(guān),收獲時(shí)間早病毒增殖尚未達(dá)到繁殖高峰;隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加,收獲高于84小時(shí),病毒繁殖達(dá)高峰后大量病毒暴露在高溫環(huán)境中失活而導(dǎo)致病毒含量下降。
表1 不同接毒比例制備病毒液病毒含量測(cè)定結(jié)果單位:TCID50/0.1m l
表2 不同時(shí)間收獲病毒液病毒含量測(cè)定結(jié)果單位:TCID50/0.1m l
[1]張玥.鴨坦布蘇病毒的分離、致病性和細(xì)胞適應(yīng)性研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.
[2]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2015年版,三部)[M].北京∶中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2016.