張浩強(qiáng)　張素萍　沈雁飛　宋　冰

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,遼寧　錦州　121000)

肥胖機(jī)體存在低水平的內(nèi)毒素血癥〔1〕，而內(nèi)毒素作為革蘭陽性菌產(chǎn)物可以激活Toll樣受體(TLRs)通路引起機(jī)體炎癥反應(yīng)〔2〕。脂肪組織的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的凋亡相關(guān)〔3〕，肥胖小鼠脂肪組織細(xì)胞凋亡增加，且膳食結(jié)構(gòu)的質(zhì)和量可以影響脂肪組織凋亡〔4〕。TLR2屬于TLRs家族中的一員，是與固有免疫相關(guān)的一種模式識別受體，能夠識別多種病原相關(guān)分子模式，與糖脂代謝有關(guān)〔2〕。TLR2缺乏可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥反應(yīng)〔5〕，因此猜想，TLR2基因可能調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用TLR2基因敲除的小鼠，并給予高脂飲食誘導(dǎo)肥胖，觀察脂肪組織凋亡相關(guān)蛋白的變化。

1　材料與方法

1.1動物分組與處理SPF級4周齡C57BL/6J雄性小鼠24只(SCXK〔京〕2009-0015,華阜康公司，北京)和TLR2基因敲除小鼠24只(022507，Jackson 實(shí)驗(yàn)室，美國)，體質(zhì)量(14±2)g，隨機(jī)分為正常對照組(NC，8只)、肥胖組(OB，16只)、TLR2基因敲除組(TK，8只)和TLR2基因敲除肥胖組(TO，16只)。自由飲水、攝食，動物房內(nèi)12 h晝夜循環(huán)，室溫(22±2)℃。專用高能量飼料(華阜康公司，北京)喂養(yǎng)OB組和TK組小鼠，小鼠全價營養(yǎng)顆粒基礎(chǔ)飼料(華阜康公司，北京)喂養(yǎng)NC組和TK組小鼠，16 w后OB組小鼠體重大于NC組小鼠上限者及TO組小鼠體重大于TK組小鼠上限者隨機(jī)各選取8只用于實(shí)驗(yàn)，其余剔除。

1.2生化指標(biāo)檢測16 w后，各組小鼠禁食6 h，心臟取血，留取血清測定空腹血糖(FPG)，三酰甘油(TG)，總膽固醇(TC)，高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。

1.3caspase3活性檢測小鼠處死后，速取部分腹腔脂肪組織，置入-80℃冰箱中備用。提取組織總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(博奧森公司，北京)測總濃度，并調(diào)整各蛋白濃度2 mg/ml，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用caspase3分光光度法檢測試劑盒(萬類，沈陽)檢測caspase3活性。

1.4Western印跡取材及蛋白定量同1.3。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電(SDS-PAGE)：分離膠(12%)及濃縮膠(5%)，每孔20 μl樣本及小分子Marker(賽默飛，上海)上樣進(jìn)行電泳。 采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉，bcl2和bax多克隆抗體(萬類，沈陽)4℃過夜，過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(ABSCI,美國)孵育2 h。用GISt020凝膠圖像分析儀及成像。

1.5熒光實(shí)時定量PCR脂肪組織總RNA采用Trizol抽提，包含反轉(zhuǎn)錄酶的RNeasy Plus Mini試劑盒(Bioneer，韓國)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，QIAGEN Fast Cycling PCR 試劑盒(Takara生物科技，大連)進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工設(shè)計(jì)并合成，bcl2：正義5′-CCCCTCGCATCTTCTCCTTCC-3′,反義5′-CCACCACCTCCTTGAGAAGTCC-3′；bax：正義5′-CCAGGATGCGTCCACCAA-3′,反義5′-CACCAACGGGAGAAGATGAAACG-3′；GAPDH：正義5′-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′,反義5′-GGATAGGGCCTCTCTTGCTCA-3′，所得數(shù)據(jù)以GAPDH mRNA作為參照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0軟件行one way NOVA方差分析，兩兩比較用LSD法和Tamhane法。

2　結(jié)　果

2.1高脂飲食和TLR2基因敲除對小鼠血糖、血脂的影響與NC組〔(6.78±0.43)、(2.64±0.06)、(0.26±0.02)、(1.46±0.02)mmol/L〕相比，OB組FPG、TG、TC和LDL水平〔(9.79±0.32)、(3.03±0.07)、(0.37±0.03)、(1.65±0.07)mmol/L〕明顯升高，HDL水平〔(1.05±0.02)mmol/L〕明顯降低(P<0.05)。與OB組相比，TO組小鼠FPG〔(6.88±0.33)mmol/L〕、TG〔(2.36±0.06)mmol/L〕、TC〔(0.12±0.02)mmol/L〕、HDL〔(0.94±0.02)mmol/L〕和LDL水平〔(1.27±0.04)mmol/L〕明顯降低(P<0.05)。TK組FPG、TG、TC、HDL、LDL水平分別為(6.37±0.46)、(2.30±0.06)、(0.08±0.01)、(0.98±0.03)、(1.19±0.03)mmol/L。

2.2高脂飲食和TLR2基因敲除對小鼠脂肪組織caspase3活性的影響OB組(35.37±2.96)與NC組(23.10±3.15)相比，小鼠脂肪組織caspase3活性明顯升高(P<0.05)，TO組(23.95±3.53)與OB組相比，小鼠脂肪組織的caspase3活性降低(P<0.05)。TK組Caspase3活性為18.28±3.93。

2.3高脂飲食和TLR2基因敲除對小鼠脂肪組織bcl2和bax蛋白的影響與NC組(0.56±0.05,0.33±0.23)相比，OB組脂肪組織bcl2蛋白量減少(0.24±0.07,P<0.05)，bax蛋白量增加(0.62±0.10,P<0.05)。與OB組相比，TO組脂肪組織bcl2蛋白量增加(0.52±0.04，P<0.05)，bax蛋白量減少(0.36±0.03，P<0.05)。與NC組(0.60±0.09)相比，OB組bax蛋白與bcl2蛋白比值(2.63±0.31，P<0.05)增加；與OB組相比，TO組bax蛋白與bcl2蛋白比值降低(0.70±0.02，P<0.05)。TK組bax蛋白量0.24±0.04，bcl2 0.73±0.07，bax/bcl2 0.33±0.10。見圖1。

2.4高脂飲食和TLR2基因敲除對小鼠脂肪組織bcl2和bax mRNA的影響與NC組(0.71±0.02，0.35±0.02)相比，OB組脂肪組織bcl2 mRNA減少(0.22±0.03，P<0.05)，bax mRNA增加(0.94±0.02，P<0.05)。與OB組相比，TO組脂肪組織bcl2 mRNA增加(0.61±0.05，P<0.05)，bax mRNA減少(0.54±0.02,P<0.05)。與NC組(0.49±0.02)相比，OB組bax mRNA與bcl2 mRNA比值增加(4.43±0.67,P<0.05)；與OB組相比，TO組bax mRNA與bcl2 mRNA比值降低(0.90±0.09,P<0.05)。TK組bcl2 mRNA為0.90±0.03，bax mRNA為0.24±0.02，bax/bcl2 mRNA為0.26±0.02。

圖1　小鼠脂肪組織bax和bcl2蛋白表達(dá)

3　討　論

TLR2與固有免疫相關(guān)，是模式識別受體家族的重要一員，能夠識別包括脂肪酸在內(nèi)的病原相關(guān)分子模式〔6〕。有研究認(rèn)為膳食結(jié)構(gòu)改變可以影響脂肪組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，且肥胖小鼠脂肪組織細(xì)胞凋亡增加〔4〕，TLR2敲除對肥胖小鼠脂肪組織細(xì)胞凋亡的影響尚不明確。caspase3和細(xì)胞凋亡相關(guān)，常作為衡量細(xì)胞凋亡程度的指標(biāo)〔7，8〕，本研究結(jié)果說明TLR2基因敲除可能減輕了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織細(xì)胞凋亡。bcl2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中的作用分為兩類：一類是以bcl2為代表的抗凋亡蛋白，一類是以bax為代表的促凋亡蛋白。bcl2和Bax可以形成異源二聚體，阻斷細(xì)胞色素(Cyt)-C的釋放，繼而抑制caspase-3蛋白活化，有效抑制細(xì)胞凋亡〔9〕bcl2和bax的比值增高提示抑制細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，反之，提示促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)，因此bax/bcl2蛋白比值決定了細(xì)胞的生存和死亡〔10,11〕。本研究提示，TLR2基因敲除可能減輕了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織細(xì)胞凋亡，并且這可能與其發(fā)揮降脂作用相關(guān)。

1Kim KA，Gu W，Lee IA，etal.High fat diet-induced gut microbiota exacerbates inflammation and obesity in mice via the TLR4 signaling pathway〔J〕.PLoS One，2012;7(10):e47713．

2Kawasaki T,Kawai T.Toll-like receptor signaling pathways〔J〕.Front Immunol,2014;5:461.

3Mocanu AO,Mulya A,Huang H,etal.Effect of Roux-en-Y gastric bypass on the NLRP3 inflammasome in adipose tissue from obese rats〔J〕.PLoS One,2015;10(10):e0139764.

4Camargo A,Rangel-Zúiga OA,Alcalá-Díaz J,etal.Dietary fat may modulate adipose tissue homeostasis through the processes of autophagy and apoptosis〔J〕.Eur J Nutr,2016.〔Epub ahead of print〕.

5Davis JE,Braucher DR,Walker-Daniels J，etal.Absence of Tlr2 protects against high-fat diet-induced inflammation and results in greater insulin-stimulated glucose transport in cultured adipocytes〔J〕.J Nutr Biochem,2011;22(11):136-41.

6Xu Y,Wang LM,He J,etal.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults〔J〕.JAMA,2013;310(9):948-58.

7Bernardi P,Rasola A.Calcium and cell death:the mitochondrial connection〔J〕.Subcell Biochem,2007;45(1):481-506.

8Lin M,Li L,Li LP,etal.The protective effect of baicalin against renal ischemia-reperfusion injury through inhibition of inflammation and apoptosis〔J〕.BMC Complement Altern Med,2014;14(1):19.

9Lee Y,Gustafsson AB.Role of apoptosis in cardiovascular disease〔J〕.Apoptosis,2009;14(4):536-48.

10Bouillet P,Purton JF,Godfrey DI,etal.BH3-only Bcl-2 familly member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes〔J〕.Nature,2002;415(6874):922-6.

11Antonsson B.Mitochondria and the Bcl-2 family proteins in apoptosis signaling pathways〔J〕.Mol Cell Biochem,2004;256(1/2):141-55.