畢 磊 ， 劉照琨 ， 關(guān)靖喆 ， 張煜涵 ， 張思遠(yuǎn) ， 路義鑫

(動物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制重點實驗室 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine protease inhibitor，SPI) 大約由350～400個氨基酸殘基構(gòu)成，具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，其分子量處于40 kDa至100 kDa不等，能夠通過自身構(gòu)象變化抑制靶酶，廣泛存在于動物、植物及微生物體內(nèi)，能夠調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命代謝過程。絲氨酸蛋白酶抑制劑在動物體內(nèi)起到調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要作用[1]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在寄生蟲感染過程中，包括入侵宿主、免疫逃避、炎癥反應(yīng)、凝血系統(tǒng)和細(xì)胞遷徙等都有絲氨酸蛋白酶抑制劑的參與[2-5]。

旋毛蟲病(Trichinellosis)是一種由旋毛蟲引起的人獸共患寄生蟲病，旋毛蟲寄生于宿主骨骼肌和腸上皮細(xì)胞，通過食源性傳播[6]，可于同一宿主完成一整個生命過程。長期的寄生伴隨的免疫抑制現(xiàn)象對旋毛蟲的防治意義重大。但旋毛蟲的免疫逃避機制尚未明確，已有研究證實，旋毛蟲排泄分泌物能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而逃避宿主免疫應(yīng)答[7]。但分泌物中的具體作用成分仍有待研究。為確定旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑是否具有類似調(diào)節(jié)功能，本研究以原核表達(dá)獲得的兩種可溶性絲氨酸蛋白酶抑制劑(TsAdSPI和TsKaSPI)為實驗對象，利用SYBR Green I實時熒光定量 PCR技術(shù)，研究旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑(TsAdSPI)和旋毛蟲Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(TsKaSPI)對J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞免疫過程中各炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用。以期證明這兩種SPIs能夠在旋毛蟲入侵宿主時通過調(diào)節(jié)宿主巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的生成影響機體免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步研究旋毛蟲免疫逃避機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及重組蛋白 J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞系，購自上海霖研生物技術(shù)有限公司。TsAdSPI和TsKaSPI重組蛋白由本實驗室已成功構(gòu)建的載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，及電洗脫純化后獲得。

1.2 主要試劑盒器材 LPS為Sigma公司產(chǎn)品；特級胎牛血清為天津灝洋公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品；rTaqDNA聚合酶、TRIZol、pMD18-T載體試劑盒、DH5α和SYBR PremixExTaqⅡ′，均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR儀為德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品；7500 Fast型實時熒光PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；UV-120-02 型紫外分光光度計為日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8法檢測重組蛋白對細(xì)胞活力的影響 J774A.1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

分別用不同濃度(1 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，15 μg/mL，20 μg/mL)的兩種重組蛋白處理巨噬細(xì)胞，同時設(shè)空白對照組和LPS(100 ng/mL)組，通過CCK-8法檢測細(xì)胞活力，確定合適的試驗組蛋白濃度。

1.4 分組處理細(xì)胞 將J774A.1細(xì)胞按每孔 1×106個細(xì)胞接種于 6孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后換液，根據(jù)試驗?zāi)康膬煞N重組蛋白(TsAdSPI和TsKaSPI)各分兩個試驗組：一組向J774A.1細(xì)胞中分別加入重組蛋白(5 μg/mL)提前作用24 h，直接加入LPS(100 ng/mL)刺激 12 h，設(shè)相同體積的 PBS 作為空白對照，LPS(100 ng/mL)刺激12 h為陽性對照組；另一組向J774A.1細(xì)胞中加入重組蛋白(5 μg/mL)單獨作用 24 h，設(shè)相同體積的PBS 作為空白對照， LPS(100 ng/mL)為陽性對照組。

1.5 細(xì)胞總mRNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 應(yīng)用TRIZol法提取上述兩種重組蛋白(TsAdSPI和TsKaSPI)處理的各組細(xì)胞的mRNA，測定RNA濃度和D值，RNA的D260/D280值應(yīng)該處于1.8～2.1之間。利用各組mRNA分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行后續(xù)PCR擴增。

1.6 熒光定量PCR方法的建立

1.6.1 熒光定量擴增引物PCR引物設(shè)計 根據(jù)GenBank登陸的小鼠Gapdh(NM-008084.2)，TNF-α(BC137720.1)，IL-1β(NC_000068.6)，IL-6(NM_031168.2)，IL-10(NM_010548.2)，IL-12(M86671.1)和TGF-β(M13177.1)基因序列，用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0分析和設(shè)計引物，經(jīng)BLAST驗證引物特異性。Gapdh基因熒光定量上游引物5′- CCAGCCTCGTCCCGTAGACA-3′，下游引物5′- ATACTCAGCACCGGCCTCACCC-3′，擴增長度為298bp；TNF-α基因熒光定量上游引物5′-TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG-3′，下游引物 5′- CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3′，擴增長度為200 bp；IL-1β基因熒光定量上游引物5′- CCTCGTGCTGTCGGACCCATA-3′，下游引物5′- CAGGCTTGTGCTCTGCTTGTGA-3′，擴增長度為344 bp；IL-6基因熒光定量上游引物5′-CGGAGAGGAGACTTCACAGAG-3′，下游引物5′-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3′，擴增長度為104 bp；IL-10基因熒光定量上游引物5′-AATAAGAGCAAGGCAGTGGAG-3′，下游引物5′- TGTATGCTTCTATGCAGTTGATGA-3′，擴增長度為115 bp；IL-12基因熒光定量上游引物5′-AAAGGCTGGGTATCGG-3′，下游引物5′-CTGGCTGTGCTGGAAC-3′，擴增長度為117 bp；TGF-β基因熒光定量上游引物5′-ATTCCTGGCGTTACCTTGG- 3′，下游引物5′-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3′，擴增長度為120 bp。以上所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 以所得cDNA為模板，用擴增引物通過PCR的方法擴增小鼠基因片段Gapdh、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TGF-β。目的片段產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，與pMD18-T載體16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，進(jìn)行質(zhì)粒提取后，經(jīng)PCR鑒定，利用紫外分光光度計測得質(zhì)粒濃度，再根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)換算公式計算出質(zhì)粒拷貝數(shù)，用ddH2O進(jìn)行倍比稀釋，稀釋成100～104共5個梯度，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 應(yīng)用SYBR Green染料法，分別對Gapdh、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TGF-β熒光定量PCR反應(yīng)過程中的反應(yīng)時間及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，所用反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性3 s，55 ℃～60 ℃退火20 s～30 s，進(jìn)行反應(yīng)40個循環(huán)。

1.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行SYBR Green反應(yīng)后，以其模板質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(lg)為X軸，以獲得的Ct值作為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為排除引物二聚體及非特異性擴增產(chǎn)物對結(jié)果的影響，分別通過熔解曲線情況分析引物特異性，并計算擴增效率。

1.7 TsAdSPI和TsKaSPI各組相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的檢測 根據(jù)步驟1.6已經(jīng)建立的熒光定量檢測體系，以步驟1.5獲得的TsAdSPI和TsKaSPI各組反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系，分別對各組樣品中相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)反應(yīng))，得到檢測樣品的Ct值。根據(jù)繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線代入各Ct值得到樣品濃度值，用△△Ct法分別計算TsAdSPI和TsKaSPI各試驗組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TGF-β基因mRNA的表達(dá)水平。

1.8 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用ABI 7500 Fast，EXCEL，DNAMAN，GraphPad Prism 5軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析。統(tǒng)計學(xué)上處理試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，同時采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行f檢驗、方差分析與相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩種重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 已構(gòu)建的TsAdSPI和TsKaSPI表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，通過SDS-PAGE檢驗誘導(dǎo)結(jié)果，經(jīng)電洗脫后獲得純化后的兩種蛋白TsAdSPI和TsKaSPI，SDS-PAGE檢驗?zāi)康臈l帶單一，大小正確，如圖1和圖2所示。

2.2 CCK8檢測兩種重組蛋白對巨噬細(xì)胞活力的影響 結(jié)果顯示，與PBS空白組相比，TsAdSPI和TsKaSPI對巨噬細(xì)胞活力均存在抑制作用，并呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴性，差異顯著(*P<0.05，**P<0.01)，如圖3和圖4所示。濃度1～5 μg/mL并未造成影響，但濃度從10 μg/mL開始明顯影響巨噬細(xì)胞增值活力。故本試驗選用5 μg/mL作為以下試驗工作濃度。

圖1 重組蛋白TsAdSPI純化結(jié)果分析

圖2 重組蛋白TsKaSPI純化結(jié)果分析

圖4 TsKaSPI重組蛋白對巨噬細(xì)胞活力的影響

2.3 檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TGF-β mRNA表達(dá)水平熒光定量PCR方法的建立

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品目的片段的擴增與標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 各標(biāo)準(zhǔn)品目的片段(Gapdh、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TGF-β)經(jīng)PCR擴增，連接轉(zhuǎn)化后，菌液由華大基因科技服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果用DNAMAN序列比對分析，與GenBank報道序列100%一致的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，經(jīng)質(zhì)粒PCR與酶切鑒定目的片段與預(yù)期大小一致(圖5)。并用紫外分光光度計檢測質(zhì)粒濃度。

圖5 重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定

2.3.2 熒光定量PCR檢測方法的建立 經(jīng)條件優(yōu)化后確定熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，退火溫度60 ℃，退火時間34 s，反應(yīng)40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)果顯示，Gapdh、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TGF-β的熔解曲線峰值單一，引物特異性良好。使用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，繪制各目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.997～1之內(nèi)，擴增效率都處于0.96～1.09之間，符合△△Ct法分析標(biāo)準(zhǔn)，可以使用△△Ct法進(jìn)行分析。

2.4 TsAdSPI和TsKaSPI對巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況的影響

2.4.1 TsAdSPI和TsKaSPI對促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12 mRNA表達(dá)的影響 通過SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測，J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)重組蛋白TsAdSPI和TsKaSPI預(yù)先作用24 h再加入LPS(100 ng/mL)刺激12 h 的處理組，與用LPS(100 ng/mL)單獨刺激24 h的陽性組相比，重組蛋白TsAdSPI和TsKaSPI均可明顯下調(diào)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-12 mRNA 的表達(dá)(**P< 0.01，*P< 0.05)，如圖6和圖7所示。其中，其中重組蛋白TsAdSPI對IL-1β mRNA表達(dá)的抑制作用最為明顯。而重組蛋白TsKaSPI對IL-6 mRNA表達(dá)的下調(diào)作用最明顯，差異極顯著(**P< 0.01)，對TNF-α和IL-12 mRNA表達(dá)的下調(diào)作用較弱，差異顯著(*P< 0.05)。

2.4.2 TsAdSPI和TsKaSPI對抗炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β mRNA表達(dá)的影響 如圖8和圖9所示，J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)重組蛋白TsAdSPI或TsKaSPI單獨作用24 h，與經(jīng)PBS作用的空白對照組相比，抗炎性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10 mRNA的表達(dá)水平均被明顯上調(diào)，差異極顯著(**P< 0.01)。

圖6 TsAdSPI抑制促炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

圖7 TsKaSPI抑制促炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

圖8 TsAdSPI促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

圖9 TsKaSPI促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

3 討論

寄生蟲產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶抑制劑在寄生蟲感染宿主和寄生過程中影響宿主體內(nèi)多種化學(xué)反應(yīng)，同時調(diào)控宿主生理功能以利于其寄生和存活[8]；并能在宿主體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，為寄生蟲在宿主體內(nèi)生存、發(fā)育、移行和定居等過程提供有利條件[9-10]。關(guān)于旋毛蟲入侵宿主時引發(fā)免疫逃避的研究還不夠深入，近年來有少量涉及旋毛蟲排泄分泌物調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞免疫功能的研究，已經(jīng)證明旋毛蟲的分泌物中存在某些抗原，能夠通過調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子之間的動態(tài)平衡對巨噬細(xì)胞的免疫活性進(jìn)行調(diào)控[7]，并且能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向替代性活化表型轉(zhuǎn)化，抑制T細(xì)胞增殖。

Goerdt S和Orfanos C E[11]的研究表明，在寄生蟲等外來病原體入侵時，巨噬細(xì)胞會通過釋放如促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-12及抗炎性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10等免疫調(diào)控因子去影響機體炎癥反應(yīng)，并誘發(fā)相關(guān)免疫反應(yīng)，以達(dá)到清除病原體的目的。王艷鳳[12]的研究表明，偽旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑rTp-Serpin可以降低LPS活化后的巨噬細(xì)胞多種促炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，也能夠促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物Arg1和抗炎性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10m RNA的表達(dá)。研究結(jié)果揭示rTp-Serpin可參與逃避宿主免疫應(yīng)答和排蟲反應(yīng)。本研究選用來源于雄性BALA/C小鼠網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤的J774A.1細(xì)胞株進(jìn)行了相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的TsAdSPI和TsKaSPI均可對J774A.1的細(xì)胞活力產(chǎn)生影響；均能夠不同程度的抑制經(jīng)LPS刺激過的J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的表達(dá)，同時單獨作用J774A.1細(xì)胞均可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成抗炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β。與王艷鳳的研究結(jié)果相一致。研究結(jié)果表明，TsAdSPI和TsKaSPI在旋毛蟲侵入宿主腸道后可作為效應(yīng)分子直接作用于宿主巨噬細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)其炎性細(xì)胞因子的分泌改變局部免疫環(huán)境，進(jìn)一步影響宿主免疫反應(yīng)的正常進(jìn)行和排蟲反應(yīng)的發(fā)生。研究TsAdSPI或TsKaSPI免疫調(diào)節(jié)功能，不僅可以為揭示旋毛蟲感染的免疫逃避機制提供理論依據(jù)，更為旋毛蟲疫苗的研發(fā)提供新方向。

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