溫和心 ， 龍英全 ， 蔣榮華 ， 盤寶進(jìn) ， 羅廣生 ， 陳立軍

(1.貴港出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 廣西 貴港 537100 ； 2.靈長類實(shí)驗(yàn)動物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 廣西 南寧 530028；3.玉林出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 廣西 玉林 530000)

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌能致人和其他多種動物發(fā)生胃腸炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥及結(jié)節(jié)性紅斑等病，是非常重要的人獸共患病病原。該細(xì)菌在我國的分布非常廣，從人群、動物、外環(huán)境和食品都可以分離出病原菌[1]。該病與人們?nèi)粘Ｉ铌P(guān)系密切，流行病學(xué)研究表明，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌能在冷藏溫度下生長繁殖，故冰箱是耶爾森菌小腸結(jié)腸炎重要的傳染源，俗稱“冰箱菌”。本自治區(qū)是實(shí)驗(yàn)猴出口大省，國際一些進(jìn)口國逐漸對猴小腸結(jié)腸炎耶爾森菌提出檢疫要求。該細(xì)菌主要以分離培養(yǎng)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，從低溫增菌到確定細(xì)菌的血清型、生物型大約需要1周的時間，耗時較長[2]，無法滿足檢疫要求?？梢暛h(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)是在LAMP體系中加入指示劑，可以目測反應(yīng)結(jié)果，既免除產(chǎn)物電泳步驟，又減少產(chǎn)物污染，克服LAMP技術(shù)易污染的缺點(diǎn)，更好地發(fā)揮LAMP技術(shù)的優(yōu)勢。 把可視LAMP技術(shù)應(yīng)用于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的快速檢測，解決當(dāng)前小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢疫，意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌CMCC5220，鼠疫耶爾森菌DNA(疫苗菌，憑祥出入境檢驗(yàn)鼠疫國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈)，假結(jié)核耶爾森菌CMCC53504，大腸桿菌ATCC25922，傷寒沙門菌CMCC50039，痢疾志賀菌ATCC51252，空腸彎曲桿菌ATCC33291，溶血性鏈球菌CMCC32121，李斯特菌ATCC19111，糞腸球菌ATCC35667，金黃色葡萄球菌ATCC6538，表皮葡萄球菌ATCC12228，銅綠假單胞菌ATCC27853，產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124，肺炎克雷伯菌CMCC46117，阪崎腸桿菌ATCC29544，奇異變形桿菌ATCC25933。

1.1.2 試劑與設(shè)備DNA大片段聚合酶試劑盒(Bst酶，Neb)，PCR試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；脫氧核苷酸(dNTP，天根生化科技(北京)有限公司)；羥基萘酚藍(lán)(HNB,Sigma公司)；甜菜堿(betaine,Sigma公司)；硫酸鎂(AR,Sigma公司)；礦物油(Sigma公司)；引物、探針(Lifetect公司)；熒光PCR儀(ABI7500)，PCR儀(ABISimpliAmp公司)；水浴鍋(上?！憧萍純x器有限公司，HWS24)；麥?zhǔn)蠞岫葍x(梅里埃(上海)生物制品有限公司，Densicheck)；紫外儀、電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠,WD-9403D、DDY-2C、DYCP-34)等。

1.1.3 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌引物設(shè)計 引物序列信息見表1。

表1 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌引物序列信息

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌濃度的標(biāo)定和DNA的提取 從平皿中挑取小腸結(jié)腸炎耶爾森菌單個菌落，接種于3 mL的營養(yǎng)肉湯中，36 ℃培養(yǎng)過夜，8 000 r/min離心2 min，棄上清，沉淀用0.9%生理鹽水洗滌、離心1次，沉淀物用去離子水懸浮，用麥?zhǔn)蠞岫确?biāo)定細(xì)菌濃度， 即1MCF≈3×108CFU/mL[4]。取菌液隔水煮沸15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清即為細(xì)菌DNA，冷凍備用。

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系高溫-低溫前處理試驗(yàn) 設(shè)A和B 2個試驗(yàn)組，A組將未添加Bst酶的反應(yīng)體系先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、開蓋加入Bst酶并混勻，最后加入150 μL礦物油，密封管蓋，63 ℃水浴1.5 h，直接目測觀察結(jié)果。B組反應(yīng)體系配制好后，直接63 ℃水浴1.5 h，目測觀察結(jié)果。A、B 2個試驗(yàn)組同時檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌DNA各稀釋度，比較兩個試驗(yàn)組的靈敏度。

1.2.3 反應(yīng)體系添加甜菜堿試驗(yàn) 設(shè)A和B 2個試驗(yàn)組，A組反應(yīng)體系含有0.8 mol/L的濃度甜菜堿，B組反應(yīng)體系不含甜菜堿，反應(yīng)程序是反應(yīng)體系(不含Bst酶)先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、開蓋加入Bst酶并混勻，最后加入150 μL礦物油，密封管蓋，63 ℃水浴1 h，直接目測觀察結(jié)果。A、B 2個試驗(yàn)組同時檢測Y.e菌DNA各稀釋度，比較兩個試驗(yàn)組的靈敏度。

1.2.4 PCR、熒光PCR、電泳LAMP、可視LAMP比較靈敏度試驗(yàn) PCR和熒光PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序均按試劑盒說明書進(jìn)行。LAMP反應(yīng)體系見表2。

表2 LAMP反應(yīng)體系

LAMP反應(yīng)體系前處理：反應(yīng)體系(不含Bst酶)先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、開蓋加入Bst酶并混勻，最后加入150 μL液體石臘，密封管蓋。

LAMP反應(yīng)程序：63 ℃水浴1 h，煮沸2 min終止反應(yīng)，取4 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，拍照分析結(jié)果?？梢昄AMP反應(yīng)體系即是在LAMP反應(yīng)體系基礎(chǔ)上加入2 mmol/L羥基萘酚藍(lán)(HNB)1.8 μL, 反應(yīng)體系前處理與反應(yīng)程序與LAMP相同，不進(jìn)行產(chǎn)物電泳，直接目測觀察結(jié)果。上述4種方法檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌DNA 各稀釋度，根據(jù)結(jié)果比較各方法的靈敏度。

1.2.5 可視LAMP特異性試驗(yàn) 將假結(jié)核耶爾森菌、大腸桿菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、空腸彎曲桿菌、溶血性鏈球菌、李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌、肺炎克雷伯菌、阪崎腸桿菌奇異變形桿菌13種常見的致病菌培養(yǎng)過夜，按1.2.1法將菌液稀釋至1MCF后，采用熱裂解法提取細(xì)菌DNA。用可視LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，檢測各細(xì)菌DNA，檢驗(yàn)可視LAMP特異性。

1.2.6 樣品基質(zhì)干擾試驗(yàn)設(shè)置2種采樣方式，取猴肛拭子、猴糞便2 g各1份置于10 mL增菌液中，36 ℃培養(yǎng)過夜，分別取上層增菌液3 mL備用。分別用增菌液按10倍遞增法稀釋1MCF濃度的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，將各個稀釋度的菌液離心，沉淀用去離子水洗滌1遍，最后用去離子水恢復(fù)至原體積，使沉淀完全懸浮。按1.2.1法熱裂解細(xì)菌提取DNA。用可視LAMP檢測所提取的DNA，比較樣品基質(zhì)對試驗(yàn)的干擾情況。

1.2.7 可視LAMP與分離鑒定法比較試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)猴繁育場分別采用可視LAMP方法和分離鑒定方法—實(shí)驗(yàn)動物耶爾森菌檢測方法(GB/T 14926.3-2001)檢測實(shí)驗(yàn)猴小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，統(tǒng)計兩種方法的檢驗(yàn)結(jié)果，比較二者的檢出率和符合率。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)體系高溫-低溫前處理試驗(yàn)結(jié)果

如中插彩版圖1所示，反應(yīng)體系經(jīng)過高溫-低溫前處理的A組敏感性是6 CFU/反應(yīng)，未經(jīng)過高溫-低溫前處理的B組敏感性只有600 CFU/反應(yīng)，A組敏感性顯著高于B組，證明高溫DNA變性-低溫促使DNA與引物結(jié)合，可顯著提高可視LAMP方法的敏感性。

2.2 反應(yīng)體系添加甜菜堿試驗(yàn)結(jié)果 反應(yīng)體系添加甜菜堿 A組敏感性是6 CFU/反應(yīng)，未添加甜菜堿B組敏感性是60 CFU/反應(yīng)，A組敏感性顯著高于B組，A、B均無假陽性產(chǎn)生，證明明甜菜堿是有助于促進(jìn)DNA變性，打開雙鏈，創(chuàng)造引物與DNA結(jié)合的有利環(huán)境，所以反應(yīng)體系中添加甜菜堿可顯著提高可視LAMP方法的敏感性。

2.3 PCR、熒光定量PCR、傳統(tǒng)LAMP、可視LAMP敏感性試驗(yàn)結(jié)果 如中插彩版圖2-A顯示小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌fox基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，產(chǎn)物長度在300 bp左右，與目標(biāo)基因311 bp相符，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量隨模板量降低而減少，最低檢出限為60 CFU/反應(yīng)。如中插彩版圖2-B顯示小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Yst基因熒光定量PCR擴(kuò)增擴(kuò)增曲線，最低檢出限為6 CFU/反應(yīng)。傳統(tǒng)LAMP和可視LAMP都可以對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PHOP基因有效地擴(kuò)增，中插彩版圖2-C 顯示，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳條帶呈典型的梯狀排列，最低檢出限為6 CFU/反應(yīng)。中插彩版圖2-D結(jié)果顯示可視LAMP，陰性管保持藍(lán)紫色無變化，陽性管變成青藍(lán)色，最低檢出限為6 CFU/反應(yīng)，證明指示劑羥基萘酚藍(lán)對LAMP反應(yīng)無不良作用。 綜合以上結(jié)果表明，可視LAMP與熒光定量PCR、傳統(tǒng)LAMP方法檢測敏感性相當(dāng)，都是6 CFU/反應(yīng)，高于PCR法敏感性60 CFU/反應(yīng)，可視LAMP目測判定結(jié)果，簡單明了，技術(shù)優(yōu)勢明顯。

2.4 可視LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果 中插彩版圖3顯示可視LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果，只有小腸結(jié)腸炎耶爾森菌呈陽性反應(yīng)，同屬的鼠疫耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森菌呈陰性反應(yīng)，大腸桿菌、糞腸球菌等腸道常見菌均呈陰性反應(yīng)，表明該可視LAMP對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌有較強(qiáng)的特異性。

2.5 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示，肛拭子組、猴糞便干擾組可視LAMP敏感性均達(dá)到6 CFU/反應(yīng)，無假陽性，表明肛拭子、猴糞便增菌培養(yǎng)物對可視LAMP的敏感度和特異無明顯影響。

2.6 可視LAMP與分離鑒定法對比試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用可視LAMP和分離鑒定法同時檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)猴肛拭子21批次共3 050頭份，結(jié)果分別檢出15份和9份陽性樣品，分離鑒定法9份陽性樣品包含于可視LAMP陽性樣品中，表明可視LAMP檢出率顯著高于分離鑒定法。不僅如此，可視LAMP法檢驗(yàn)效率高于細(xì)菌分離鑒定法，結(jié)果判定直觀明了，可以顯著提高猴場小腸結(jié)腸炎耶爾菌檢疫技術(shù)水平。

3 結(jié)論

本研究的創(chuàng)新在于在環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增反應(yīng)體系中引入指示劑形成可視LAMP，根據(jù)反應(yīng)管顏色變化判斷結(jié)果，減少了原有技術(shù)開蓋凝膠電泳步驟

和由此造成氣溶膠污染，使LAMP技術(shù)實(shí)用價值更高。本研究證明了對反應(yīng)體系進(jìn)行高溫-低溫變溫前處理、在反應(yīng)體系中添加甜菜堿等措施均可顯著提高反應(yīng)靈敏度。據(jù)此建立的可視LAMP檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌方法的靈敏度與傳統(tǒng)LAMP相同，與熒光PCR相當(dāng)，顯著高于PCR。該方法與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌呈特異性反應(yīng)，與耶爾森菌屬其他細(xì)菌和腸道常見菌呈陰性反應(yīng)。反應(yīng)受肛拭子或糞便樣品基質(zhì)干擾不顯著?？梢娍梢昄AMP檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌操作方便快捷，結(jié)果靈敏準(zhǔn)確，設(shè)備要求簡單，特別適合基層或野外作業(yè)，是有推廣應(yīng)用價值檢測技術(shù)。

參考文獻(xiàn):

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