謝 沖，管陽太

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200127

最新的疾病負擔研究顯示，在中國，導致早死所致生命損失年（years of life lost，YLL）最高的疾病是腦卒中[1]。最新流行病學數(shù)據(jù)顯示，中國腦卒中的年齡標化患病率、發(fā)病率和死亡率分別為1 114.8/10萬、246.8/10萬人年和114.8/10萬人年；中國農(nóng)村居民腦卒中發(fā)病率（298.2/10萬人年）顯著高于城市居民（203.6/10萬人年）[2]。腦卒中嚴重影響人民的健康，同時也給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。國家衛(wèi)生健康委員會腦卒中防治工程委員會發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國腦卒中患者約700萬人，每年因腦卒中帶來的經(jīng)濟負擔達400億元[3]。因此，如何有效地治療腦卒中以及促進腦卒中患者的功能恢復是目前亟待解決的重大難題。

腦卒中后及時的康復訓練可以促進大腦的重塑和神經(jīng)功能的恢復[4]，但是恢復的效果隨著時間的遷延而減退，并且神經(jīng)功能恢復在數(shù)月后進入“高原期”。由此說明，神經(jīng)的內(nèi)源性修復存在時間局限性[5]。在組織學水平上，通過促進神經(jīng)和血管的再生可以提高神經(jīng)功能恢復的水平。然而，迄今為止，所有通過促進內(nèi)源性神經(jīng)修復來改善腦卒中患者臨床癥狀的藥物嘗試都是失敗的[6]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，促使研究者關注于探索促進神經(jīng)修復的外源性方法。

隨著干細胞研究的不斷深入，以神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）為基礎的細胞治療在腦卒中和神經(jīng)退行性疾病的治療中顯示出巨大的應用潛力。多項研究表明，NSC可以延長腦卒中藥物干預的時間窗，減少梗死面積，改善神經(jīng)缺損癥狀，促進神經(jīng)修復[7-8]。當前有關NSC治療腦卒中的臨床前研究日益增多[9]。2016年8月，Lancet報道了首個人源性NSC治療缺血性腦卒中Ⅰ期臨床試驗的結(jié)果，目前Ⅱ期臨床試驗正在進行之中[10]。本文旨在總結(jié)近年來NSC從實驗室進入臨床試驗的進程，并探討NSC治療機制及臨床應用前景，以期為更多高質(zhì)量臨床試驗的開展提供文獻支持。

1 NSC治療腦卒中的機制

為提高和優(yōu)化NSC的治療價值，從細胞學、分子學和生物學角度理解NSC發(fā)揮治療效果的機制至關重要。目前認為，NSC主要通過以下三個方面的機制發(fā)揮治療作用：一是直接替代梗死組織中的神經(jīng)元，修復神經(jīng)通路；二是通過旁分泌、免疫調(diào)控等手段發(fā)揮神經(jīng)保護作用；三是促進內(nèi)源性神經(jīng)和血管再生。

1.1 直接的細胞替代

內(nèi)源性NSC主要存在于血管微環(huán)境中，其中大部分保持未分化狀態(tài)，通過直接接觸或釋放可溶性因子與周圍環(huán)境相互作用。在梗死病灶中，內(nèi)源性NSC很少通過直接參與分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞以實現(xiàn)組織修復。注射入體內(nèi)的外源性NSC則可以在體內(nèi)進行遷移并分化為神經(jīng)細胞。注射入體內(nèi)的NSC可以分化為多種類型的細胞，包括神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，且部分細胞表達血管特異性標志物[11-12]。然而，單純的細胞替代學說正在受到質(zhì)疑，這是因為其治療效果往往并不與外源性細胞的存活或分化比例相關[13-14]。總之，雖然移植的NSC在體內(nèi)表現(xiàn)出一定的存活和分化能力，但尚未對此達成共識，因此僅用細胞替代學說以解釋NSC的治療作用尚不全面。

1.2 改善宿主局部微環(huán)境

在NSC移植后，宿主腦組織內(nèi)的細胞增殖會顯著增強[12,15]。移植的NSC增強內(nèi)源性神經(jīng)再生的原因可能與釋放某些神經(jīng)營養(yǎng)因子或抑制局部炎癥和細胞凋亡有關。人源性NSC可以分泌多種營養(yǎng)因子，從而直接促進內(nèi)源性神經(jīng)再生[15-18]。

研究表明，腦卒中后3個月時，腦組織內(nèi)仍然存在炎癥，抑制腦室下區(qū)（subventricular zone，SVZ）的細胞增殖，而外源性NSC可以逆轉(zhuǎn)這一過程[12]。注射NSC后，可以觀察到NSC通過借助各種黏附因子和炎性細胞因子而最終到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）病灶周圍，而CNS病灶周圍的CD45＋淋巴細胞數(shù)量明顯減少，CNS內(nèi)浸潤的CD4＋T細胞所占比例及絕對數(shù)量均明顯下降[19-20]。

1.3 促進血管再生

血管再生是組織再生的一個必備和先決條件，而移植的NSC同樣可以增加病灶的血供。人源性NSC在體外可以釋放血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），而VEGF可以通過促進新生血管生成以增加局部組織的血供[21-22]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，NSC可以增加缺血大鼠模型的血供，在移植NSC后12～14 d，缺血組織的血供可以恢復至基線水平[23]。NSC還可以通過分泌表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）以影響血管內(nèi)皮細胞的生成。還有研究發(fā)現(xiàn)，NSC可以通過直接接觸方式以促進血管內(nèi)皮的生成[7,13]。NSC與血管內(nèi)皮細胞在空間上逐漸靠近，促使血管內(nèi)皮細胞形成新生血管，而血管內(nèi)皮細胞反過來又可通過釋放可溶性因子以促進NSC分化。血管再生與神經(jīng)再生在時間和空間上存在嚴密調(diào)控和相互協(xié)調(diào)的關系。

2 人源性NSC制備技術(shù)的發(fā)展

人源性NSC是一種較好的腦卒中治療選擇，這是因為NSC可以在體外通過特定培養(yǎng)基和營養(yǎng)因子（如EGF、FGF等）進行規(guī)模性增殖，并且由于NSC具有自我增殖的特性，因此可以不斷地傳代下去，從而避免了細胞來源不足的難題。早期的人源性NSC大多來源于捐獻的胚胎，而隨著誘導多能干（induced pluripotent stem，iPS）細胞技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)實現(xiàn)了從體細胞到誘導NSC的轉(zhuǎn)化，從而解決了取材困難和免疫排斥的難題。然而，在應用人源性NSC時同樣面臨一些問題，如NSC培養(yǎng)所形成的細胞球內(nèi)混雜著不同增殖階段的干細胞或前體細胞，細胞的同質(zhì)性較差，從而影響干細胞實驗結(jié)果的效力[24]。此外，實驗發(fā)現(xiàn)，人源性NSC會隨著不斷地傳代，表現(xiàn)出增殖活性降低、基因突變增多等現(xiàn)象，而傳代細胞在細胞活力和分化潛力上亦不盡相同[25-26]。為解決上述問題，轉(zhuǎn)錄因子Myc被用于人源性NSC的改造。實驗發(fā)現(xiàn)，Myc可以延長NSC的傳代周期，保持NSC基因型的穩(wěn)定，進而形成“永生細胞系”[27]。

ReNeuron公司生產(chǎn)的CTX細胞是一種成熟的人源性NSC產(chǎn)品，被當前絕大多數(shù)臨床前實驗和臨床研究所應用。CTX細胞的主要作用是將c-Myc基因連同控制元件插入NSC基因中，在維持細胞多能性和增殖活性的同時，通過控制元件以確保細胞處于相同的增殖階段，并批量保存于“細胞銀行”中。一旦細胞被輸注入體內(nèi)，c-Myc與控制元件發(fā)生甲基化而失去作用，可防止干細胞的永久增殖。隨著技術(shù)的進步，CTX細胞已逐步實現(xiàn)自動化生產(chǎn)和儲存，出廠后可以直接進行臨床注射使用，而無需進行再次復蘇與檢測，真正實現(xiàn)了商業(yè)化隨取隨用。

3 NSC治療缺血性腦卒中的臨床前研究

在開展臨床試驗之前，研究者通過開展大量的臨床前研究以評估NSC治療缺血性腦卒中的安全性和有效性。最常采用的缺血性腦卒中動物模型為大鼠線栓法大腦中動脈阻斷（middle cerebral artery occlusion，MCAo）模型。線栓法的基本原理是通過線栓阻閉大腦中動脈起始部，造成大腦中動脈供血區(qū)缺血，從而使大鼠發(fā)生局灶性腦缺血，引發(fā)局部腦組織缺血性壞死，繼而表現(xiàn)出各種神經(jīng)功能缺損癥狀。此方法的優(yōu)勢是穩(wěn)定性好、重復性好、損傷小、梗死部位確切且成功率高。通過開展MCAo模型實驗，研究者已積累了大量有關NSC治療缺血性腦卒中的數(shù)據(jù)（表1），為NSC治療腦卒中臨床研究的開展奠定了基礎。

多項使用CTX細胞的動物實驗表明，人源性NSC在大鼠體內(nèi)可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，可有效改善MCAo模型大鼠的運動與感覺功能，但是對于高級認知功能（如記憶和學習）則無明顯的改善作用[11-12]。大鼠神經(jīng)功能的改善與腦內(nèi)注射的外源性NSC數(shù)量成正比，而不與最終存活的外源性NSC數(shù)量成正比，由此說明外源性NSC的治療作用并不直接依賴于存活細胞所發(fā)揮的神經(jīng)細胞替代作用，而可能與注射的外源性NSC的旁分泌作用（神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放）有關，旁分泌機制可導致內(nèi)源性神經(jīng)再生能力的加強[12]。除了CTX細胞，其他人源性NSC系也被應用于缺血性腦卒中的動物實驗。研究者同樣發(fā)現(xiàn)人源性NSC可以改善大鼠的神經(jīng)功能、減少梗死面積，且外源性NSC還具有免疫調(diào)節(jié)特性，可以通過調(diào)控白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10等炎性細胞因子的分泌以抑制腦組織的局部炎癥，促進內(nèi)源性神經(jīng)再生和血管生成[28-29]。除了人源性NSC以外，鼠源性NSC也被應用于MCAo模型的治療。CHEN等[30]發(fā)現(xiàn)，外源性NSC改善神經(jīng)功能的作用可能與調(diào)控內(nèi)源性NSC的分化有關，即增強神經(jīng)元的生成而抑制NSC向膠質(zhì)細胞分化。

表1 NSC治療缺血性腦卒中臨床前研究

4 NSC治療缺血性腦卒中的臨床研究

目前已完成或正在進行中的2項人源性NSC治療缺血性腦卒中的臨床試驗均采用CTX細胞。PISCES Ⅰ期臨床試驗[10]已完成，數(shù)據(jù)已發(fā)表，PISCES Ⅱ期臨床試驗目前已完成患者招募工作。

第1項人源性NSC治療缺血性腦卒中的臨床試驗是在英國完成的，這項PISCES Ⅰ期臨床試驗的結(jié)果顯示，NSC可以改善患者的神經(jīng)癥狀評分，且未發(fā)現(xiàn)嚴重不良反應[10]。PISCES Ⅰ期臨床試驗是一項開放的單臂研究，入組患者為11例年齡為60歲以上的處于穩(wěn)定期的缺血性腦卒中男性患者，接受1×106、5×106、10×106或20×106個CTX細胞的腦內(nèi)注射；主要終點事件是腦內(nèi)注射CTX細胞的安全性和耐受性，次要終點事件是治療后24個月時的神經(jīng)功能評分[10]。在整個研究期間，未發(fā)現(xiàn)CTX細胞相關不良事件；4例患者出現(xiàn)與腦內(nèi)注射相關的無癥狀性不良反應，未引發(fā)癲癇[10]。研究結(jié)果顯示，腦內(nèi)注射CTX細胞后，隨著時間的推移，患者的美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分有所改善，但是Barthel指數(shù)和上下肢Ashworth分級評分均無明顯改善；腦內(nèi)注射CTX細胞后第12個月，4例患者的改良Rankin評分表現(xiàn)為1個級別的改善，其余7例患者的改良Rankin評分無明顯變化；腦內(nèi)注射CTX細胞后第24個月，7例患者的改良Rankin評分無明顯變化，1例患者的改良Rankin評分表現(xiàn)為2個級別的惡化，3例患者的改良Rankin評分表現(xiàn)為1個級別的改善[10]。

由于PISCES Ⅰ期臨床試驗[10]入組患者少，且未設對照組，因此該研究結(jié)論的可靠性尚待驗證。在完成PISCES Ⅰ期臨床試驗后，PISCES Ⅱ期臨床試驗也已正式啟動，納入大腦中動脈區(qū)缺血性腦卒中后遺留上肢癱瘓的40歲以上男性或女性患者，至少21例；試驗設計為多中心、單臂、開放研究；每一例入組患者在腦卒中后3個月時，接受腦內(nèi)注射20×106個CTX細胞（即PISCESⅠ期臨床試驗中采用的最高細胞數(shù)）；觀察周期為12個月，主要終點事件為上肢功能恢復情況以及包括NIHSS評分、Barthel指數(shù)、改良Rankin評分在內(nèi)的神經(jīng)功能和殘疾度指標。

5 小結(jié)與展望

本文從治療機制、制備技術(shù)、臨床前研究和臨床研究等方面詳細回顧了人源性NSC從實驗室走入臨床應用的進程。目前的臨床前研究和Ⅰ期臨床試驗均顯示出NSC治療缺血性腦卒中的光明前景。然而，目前已開展的臨床試驗尚存在不少局限，如樣本量小、觀察期短，以至于無法發(fā)現(xiàn)相對少見的不良反應（包括成瘤性）。外源性NSC在注射入人體后，必須嚴密監(jiān)測其增殖特性，以防腫瘤生成。此外，值得關注的是，目前開展的臨床研究均未詳細規(guī)范入組患者的生活方式和康復鍛煉方法，而這些對于慢性缺血性腦卒中患者而言十分重要，長期的生活方式和康復鍛煉方式的差異可能會干擾研究結(jié)果，因此后續(xù)研究應將此納入考量。

總之，今后有待開展更多設計合理的NSC治療缺血性腦卒中的臨床研究，以推動NSC在缺血性腦卒中患者中的合理應用。