鐘華,董潔,董寬虎*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.北京市科學(xué)技術(shù)情報研究所，北京 100044)

扁蓿豆(Medicagoruthenica)是豆科苜蓿屬植物，又名花苜蓿、野苜蓿、扁豆子、扁豆草、扁蓄豆、網(wǎng)果葫蘆巴等[1]，具有抗干旱，耐鹽堿，耐瘠薄，耐寒冷，產(chǎn)量高，葉量豐富和適應(yīng)性強等優(yōu)點，是我國北方分布較廣的牧草之一[2]。目前對扁蓿豆抗性的研究多集中于其抗旱性，耐鹽性研究較少，主要是通過鹽脅迫下扁蓿豆種子萌發(fā)、幼苗生長及生理響應(yīng)等評價其耐鹽性差異，而對脯氨酸合成和降解關(guān)鍵酶在鹽脅迫過程中的變化研究較少[3-9]。

脯氨酸是分布廣泛的一類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物在逆境脅迫條件下可以通過增加合成、減少降解而在體內(nèi)累積大量脯氨酸，這對于防止?jié)B透脅迫對植物造成傷害、清除自由基、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有重要意義[10]。植物體內(nèi)脯氨酸的積累與其合成和降解有關(guān)，鳥氨酸(Orn)途徑和谷氨酸(Glu)途徑是植物體內(nèi)脯氨酸合成的兩條重要途徑，而這兩種途徑則因物種不同、生境變化等因素而有所差異[11]。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鳥氨酸-δ氨基轉(zhuǎn)移酶(δ-OAT)分別是Glu途徑和Orn途徑的關(guān)鍵酶。脯氨酸脫氫酶(ProDH)是脯氨酸降解過程中的限速酶[12]。

本試驗采用鹽堿化草地上的野生扁蓿豆種子，在不同濃度梯度的不同鹽(中性鹽、堿性鹽)脅迫下，對其脯氨酸積累及代謝關(guān)鍵酶活性進(jìn)行研究，以期為扁蓿豆耐鹽性研究及抗鹽育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子來源

試驗用扁蓿豆種子于2009年秋季采自山西省右玉縣威遠(yuǎn)鎮(zhèn)后所堡的鹽堿化草地(112°19′17.6″ E，39°59′17.0″ N，海拔1340 m)，保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系種質(zhì)資源庫。

1.2 試驗方法

試驗于2010年，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實驗室日光溫室內(nèi)進(jìn)行，溫室平均溫度為20～25 ℃，相對濕度為65%～75%。試驗采用盆栽法，盆口內(nèi)徑25 cm、高20 cm，裝入2∶1的蛭石與珍珠巖(V/V)，插入PVC管以便澆水及營養(yǎng)液。選取大小均等、籽粒飽滿的扁蓿豆種子直接播種，播種量50粒/盆，共播種39盆。出苗后隔天澆灌Hoagland營養(yǎng)液，其他時間定期澆水以平衡蒸發(fā)量。出苗6周后開始鹽脅迫處理。本實驗的鹽脅迫處理分別為NaCl、Na2CO3溶液，各設(shè)7個濃度，即0(CK)、50、100、200、300、400、500 mmol·L-1，每個處理3個重復(fù)。蒸發(fā)量以稱重法確定，每天按50 mmol·L-1的濃度梯度進(jìn)行遞增，直至達(dá)到指定的濃度為止。脅迫一周后取樣，保存于-80 ℃冰箱中待測。

1.3 測定指標(biāo)

脯氨酸(Pro)含量的測定采用酸性茚三酮比色法[13]；吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的提取與活性測定參照文獻(xiàn)[14-15]的方法進(jìn)行；鳥氨酸-δ氨基轉(zhuǎn)移酶(δ-OAT)的提取與活性測定參照文獻(xiàn)[16-17]的方法進(jìn)行；脯氨酸脫氫酶(ProDH)的提取與活性測定參照Lutts等[18]的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對扁蓿豆葉片和根系Pro含量的影響

NaCl和Na2CO3脅迫下，扁蓿豆根系和葉片中Pro含量均隨濃度的增加而呈先升后降的趨勢，并均在鹽濃度400 mmol·L-1時達(dá)到最大值(表1)。在不同濃度NaCl脅迫下，當(dāng)NaCl濃度≥100 mmol·L-1時，扁蓿豆葉片中Pro含量均高于根系；而不同濃度Na2CO3脅迫下，扁蓿豆葉片中Pro含量均低于根系。

2.2 鹽脅迫對扁蓿豆葉片和根系P5CS活性的影響

NaCl脅迫下，扁蓿豆根系和葉片中P5CS活性均隨濃度增加而升高(表2)。Na2CO3脅迫下，扁蓿豆根系和葉片中P5CS活性除在濃度為50 mmol·L-1時與CK差異不顯著(P>0.05)外，均隨鹽濃度增加而升高，在濃度為500 mmol·L-1時達(dá)到最高。在相同鹽的同一脅迫濃度下，葉片中P5CS活性均高于根系。

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Means in the same column with different small letters are the significant difference (P<0.05). The same below.

表2 不同鹽脅迫下扁蓿豆P5CS活性的變化Table 2 Changes in P5CS activity in M. ruthenica under different salinity stresses (U·mg-1 protein)

2.3 鹽脅迫對扁蓿豆葉片和根系δ-OAT活性的影響

NaCl脅迫下，扁蓿豆葉片中δ-OAT活性隨濃度增加而升高，而根系中δ-OAT活性則隨濃度增加呈先升后降的趨勢，濃度為400 mmol·L-1時顯著(P<0.05)高于其他濃度；且在相同濃度脅迫下，扁蓿豆葉片中δ-OAT活性普遍高于根系(表3)。Na2CO3脅迫下，扁蓿豆葉片和根系中δ-OAT活性均隨濃度增加呈先升后降的趨勢，濃度為400 mmol·L-1時顯著(P<0.05)高于其他濃度；且在濃度為200～400 mmol·L-1時，扁蓿豆根系中δ-OAT活性高于葉片。

表3 不同鹽脅迫下扁蓿豆δ-OAT活性的變化Table 3 Changes in δ-OAT activity in M. ruthenica under different salinity stresses (U·mg-1 protein)

2.4 鹽脅迫對扁蓿豆葉片和根系ProDH活性的影響

NaCl和Na2CO3脅迫下，扁蓿豆根系和葉片中ProDH活性均隨濃度增加而降低(表4)。在NaCl脅迫下，當(dāng)鹽濃度達(dá)到200 mmol·L-1時，扁蓿豆葉片和根系中ProDH活性顯著降低(P<0.05)。在Na2CO3鹽濃度300 mmol·L-1時，扁蓿豆根系中ProDH活性顯著降低(P<0.05)。在相同鹽的同一濃度脅迫下，扁蓿豆根系中ProDH活性均高于葉片。

表4 不同鹽脅迫下扁蓿豆ProDH活性的變化Table 4 Changes in ProDH activity in M. ruthenica under different salinity stresses (U·mg-1 FW)

3 討論

3.1 鹽脅迫對扁蓿豆幼苗Pro含量變化的影響

在逆境條件下，植物往往通過產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來形成適應(yīng)性反應(yīng)，因此，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物適應(yīng)逆境脅迫的基本特征之一。脯氨酸的積累可以增加植物對滲透脅迫的耐性，提高其抗脅迫能力[19]。本研究結(jié)果表明，在不同濃度NaCl和Na2CO3脅迫下，扁蓿豆幼苗根系和葉片中Pro含量均隨濃度增加而顯著(P<0.05)升高，這說明扁蓿豆幼苗通過根系和葉片中積累Pro來緩解鹽脅迫損傷。然而，NaCl和Na2CO3脅迫對其根系和葉片中Pro積累的影響存在差異。NaCl脅迫下，葉片中Pro含量高于根系，這與在菊苣(Cichoriumintybus)[12]中的結(jié)果一致；而Na2CO3脅迫下，根系中積累的Pro含量高于葉片，這與在梭梭(Haloxylonammodendron)[20]及沙棘(Hippophaerhamnoides)[21]等植物的研究結(jié)果相似，即植物受到堿性鹽的傷害作用大于中性鹽。NaCl和Na2CO3濃度為400 mmol·L-1時，扁蓿豆葉片和根系中的Pro含量顯著高于其他濃度，說明此時扁蓿豆對這兩種鹽脅迫的耐受性最強，鹽濃度繼續(xù)增加將導(dǎo)致扁蓿豆幼苗滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂，因此，扁蓿豆承受NaCl和Na2CO3脅迫時濃度不宜超過400 mmol·L-1。

3.2 鹽脅迫對扁蓿豆幼苗Pro代謝關(guān)鍵酶活性變化的影響

鹽脅迫下，植物體內(nèi)Pro代謝關(guān)鍵酶活性變化直接決定著Pro的合成和分解代謝。本試驗中扁蓿豆根系和葉片中P5CS和δ-OAT活性均隨NaCl和Na2CO3濃度的增加而升高，而ProDH活性隨NaCl和Na2CO3濃度的增加而降低，這說明鹽脅迫條件下扁蓿豆葉片和根系內(nèi)Pro含量升高是主動積累(合成代謝的加強和分解代謝的抑制)的結(jié)果，這與Kavi等[22]的研究結(jié)果相似。扁蓿豆根系和葉片中P5CS和δ-OAT活性的增強，表明其Pro合成代謝的加強，而ProDH活性降低則表明其Pro分解代謝受到抑制，這表明扁蓿豆受到了外界脅迫[23]，這與孫聰聰?shù)萚24]、董秋麗等[25]的研究結(jié)果相一致。

鹽脅迫下，植物體內(nèi)P5CS活性會受到Pro反饋調(diào)節(jié)，而δ-OAT活性則不受Pro反饋抑制[26]。趙福庚等[27]研究表明，鹽脅迫會激活Pro合成的Glu途徑和Orn途徑，NaCl濃度為200 mmol·L-1時，大麥(Hordeumvulgare)的Pro合成途徑由Glu途徑為主逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐設(shè)rn途徑為主，臨界濃度則因植物種類及植物對鹽脅迫的敏感程度而異。本試驗中，NaCl和Na2CO3脅迫下，P5CS和δ-OAT活性升高，且高濃度脅迫下顯著高于CK，這說明NaCl和Na2CO3脅迫下扁蓿豆Pro合成是Glu途徑和Orn途徑共同作用的結(jié)果。然而，NaCl和Na2CO3濃度為500 mmol·L-1時，扁蓿豆根系和葉片中Pro含量已顯著(P<0.05)下降，其P5CS活性卻仍顯著(P<0.05)升高，而其δ-OAT活性顯著(P<0.05)下降，這說明扁蓿豆根系和葉片中Pro積累受Orn途徑變化影響最大，所以NaCl和Na2CO3脅迫下扁蓿豆根系和葉片中Pro積累以O(shè)rn途徑為主。這與NaCl和Na2CO3脅迫下菊苣[12]、裸燕麥(Avenanuda)[28]、銀杏(Ginkgobiloba)[24]和堿地風(fēng)毛菊(Saussurearuncinata)[29]等植物幼苗脯氨酸代謝的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

NaCl和Na2CO3脅迫下，扁蓿豆幼苗通過提高其Pro含量以緩解滲透脅迫造成的傷害。扁蓿豆幼苗內(nèi)Pro含量的升高是主動積累的過程，并由Glu途徑和Orn途徑共同作用的結(jié)果，但以O(shè)rn途徑為主。扁蓿豆所承受的NaCl和Na2CO3濃度不宜超過400 mmol·L-1。

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