孫傳強(qiáng)，龔子珊，郭廣宏，田亞平，趙學(xué)玒，汪 曣*

(1.天津大學(xué) 精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；2.中國人民解放軍總醫(yī)院 生化科，北京 100853)

微量元素雖然在人體內(nèi)含量不多，但對人的生命活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用，其攝入過量或不足均會(huì)不同程度地引起人體生理的異常或疾病發(fā)生。如Cu、Fe、Zn是人體必需的微量元素，是相關(guān)蛋白(金屬蛋白)和酶(金屬酶)的必要組成部分[1-2]，而長期暴露在高Al、Ga、As、Cd、Hg、Tl、Pb等元素的環(huán)境中會(huì)對人體造成巨大傷害[3-10]。因此，建立人體血清中微量元素準(zhǔn)確有效的檢測方法，對考察人體內(nèi)微量元素的含量水平至關(guān)重要。

目前可用于人體微量元素檢測的方法有原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法、原子熒光光譜法、分子光譜法、X射線熒光光譜法、生化法、電化學(xué)分析法(電位溶出法)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等[11-15]，在臨床醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用的方法主要為生化法、電化學(xué)分析法、原子吸收光譜法，但生化法和電化學(xué)分析法結(jié)果的準(zhǔn)確性差。原子吸收法是目前公認(rèn)的比較優(yōu)越的元素檢測方法，但其線性范圍窄、使用單一元素的檢測方式，難以滿足實(shí)際樣品中多種痕量元素同時(shí)檢測的需求。電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)是一種能夠?qū)崿F(xiàn)多元素痕量檢測的分析技術(shù)，在人體微量元素臨床檢測方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

本文針對人血清樣品，使用直接稀釋的樣品前處理方法，選擇與人血清pH值、基質(zhì)相近的堿性稀釋劑，通過優(yōu)化儀器參數(shù)及檢測條件，實(shí)現(xiàn)了對人血清中部分有益元素、有毒有害元素共10種元素的同時(shí)檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

NexION 300D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國鉑金埃爾默(Perkin Elmer)公司產(chǎn)品，配有四極桿碰撞/反應(yīng)池(具有標(biāo)準(zhǔn)模式(無氣體)、碰撞模式(KED)、反應(yīng)模式(DRC)3種工作模式可切換)。接口錐系統(tǒng)包括鎳制的采樣錐和截取錐，以及鋁制的超截取錐。儀器工作參數(shù)：ICP射頻功率1 600 W；冷卻氣流速為18 L/min，輔助氣流速為1.10 L/min,霧化氣流量0.98 L/min；跳峰掃描模式，駐留時(shí)間50 ms；Cu、Zn、Cd、Hg、Tl、Pb元素測量使用標(biāo)準(zhǔn)模式，F(xiàn)e、Ga、As元素使用KED模式，碰撞氣為氦氣，Al元素使用DRC模式，反應(yīng)氣為氨氣。

每次在進(jìn)樣分析前需對儀器進(jìn)行調(diào)諧校準(zhǔn)，調(diào)諧方法如下：用質(zhì)量濃度為1 μg/L的調(diào)諧液(Perkin Elemer公司)對儀器進(jìn)行調(diào)諧，當(dāng)信號(hào)強(qiáng)度Be>2 000 counts/s，In>40 000 counts/s，U>30 000 counts/s，背景噪聲在質(zhì)量數(shù)220處響應(yīng)值≤1，氧化物產(chǎn)率CeO+/Ce+≤2.5%，雙電荷產(chǎn)率Ce2+/Ce+≤3%時(shí)，認(rèn)為儀器調(diào)諧通過，可以正常工作。

1.2 主要材料與試劑

超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)是由Milli-Q Advanced A 10系統(tǒng)(Millipore公司，美國)制備得到；混合元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V和Zn，100.0 μg/mL)由國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供；Hg、Rh、In、Bi單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)由國家鋼鐵研究總院提供；調(diào)諧液(Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb和U，1%HNO3介質(zhì)，1 μg/L)，TritonX-100由珀金埃爾默(PerkinElmer)公司提供；正四丁基氫氧化銨(體積分?jǐn)?shù)為40%)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，高純)購自Alfa Aesar公司；ClinChek?-Control人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自德國Recipe公司。

稀釋劑成分：0.5% 正四丁基氫氧化銨溶液、0.3% TritonX-100和0.5% EDTA，其他成分為超純水。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用稀釋劑稀釋100倍，得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的母液，使用時(shí)逐級(jí)稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立首先對人血清分析物進(jìn)行半定量分析實(shí)驗(yàn)。半定量分析的準(zhǔn)確度較差，存在±30%的誤差，僅用于預(yù)估標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍。經(jīng)分析，各元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度設(shè)定為Fe、Cu、Zn元素：5、10、20、50、100 μg/L；Al、Ga、As、Cd、Tl、Pb元素：0.05、0.1、1、5、10 μg/L；Hg元素：0.05、0.1、0.5、1、2 μg/L。

1.3.2樣品處理健康成年人血清樣本由中國人民解放軍總醫(yī)院提供。人血清樣本保存在-18 ℃下，用時(shí)提前置于室溫解凍，振蕩均勻后，取一定量的人血清樣品，用稀釋劑稀釋10倍，混勻待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜干擾

為消除多原子離子的干擾，對碰撞/反應(yīng)池條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括碰撞氣體流速、反應(yīng)氣體流速以及RPq值(即多極桿工作參數(shù))，優(yōu)化后的條件如表1所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氨氣反應(yīng)模式下適合Al元素的檢測，而氦氣碰撞模式有利于消除ArO、ClO2、ArCl等多原子離子對Fe、Ga和As元素的干擾，其他元素用標(biāo)準(zhǔn)模式即可。

表1 碰撞反應(yīng)池參數(shù)設(shè)置Table 1 The parameters of collision/reaction cell(CRC)

2.2 內(nèi)標(biāo)元素的選擇

內(nèi)標(biāo)元素的選擇主要基于分析元素的質(zhì)量數(shù)和電離能，一般選擇質(zhì)量數(shù)和電離能與分析元素相近的元素作為內(nèi)標(biāo)。為了更好地校正非質(zhì)譜干擾，本實(shí)驗(yàn)使用多種內(nèi)標(biāo)元素進(jìn)行校正。Sc常用以校正低質(zhì)量數(shù)的元素(質(zhì)量數(shù)為6～70)，但在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Sc作為內(nèi)標(biāo)的測試結(jié)果不穩(wěn)定，可能與檢測的樣品基體復(fù)雜有關(guān)，因此選擇Rh元素校正低質(zhì)量數(shù)的元素(Al、Fe、Ga、Cu、Zn、As)，In元素校正中間質(zhì)量數(shù)的元素(Cd)，Bi元素校正高質(zhì)量數(shù)的元素(Hg、Tl、Pb)。

2.3 方法線性、檢出限與定量下限

本研究考慮到人血清中待測元素濃度差異，配制3套低高濃度元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度范圍如“1.3.1”所述。先后進(jìn)樣各套濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液各元素質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo)，離子計(jì)數(shù)值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表2所示，所有元素的線性良好，相關(guān)系數(shù)不小于0.999 6，可以滿足微量元素準(zhǔn)確定量分析的需求。

表2 線性相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限及回收率Table 2 Correlation coefficient,detection limits，quantification limits and recovery

通過獨(dú)立測量11次空白溶液的信號(hào)強(qiáng)度，以其標(biāo)準(zhǔn)偏差乘以3并反演濃度求得方法的檢出限(LOD)，其標(biāo)準(zhǔn)偏差乘以10并反演濃度求得定量下限(LOQ)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2。10種待測元素的LOD為0.9 ng/L～0.346 μg/L，LOQ為0.003～1.142 μg/L，均遠(yuǎn)低于正常人血清中各元素含量。

2.4 加標(biāo)回收率與精密度

實(shí)驗(yàn)根據(jù)分析元素在樣品中的含量差異，不同元素設(shè)置不同的加標(biāo)量，一般加標(biāo)量為待分析元素含量的0.5～2.0倍，計(jì)算得各元素的加標(biāo)回收率為87.2%～111.2%(表2)。

表3 人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測結(jié)果Table 3 Results of trace elements in human serum standard from ClinChek?-Control

通過6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，計(jì)算濃度結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)求得精密度。對于Ga、As、Cd、Hg、Tl、Pb等含量較低的元素，精密度的測量是通過向?qū)嶋H樣品中加入1 μg/L分析元素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，計(jì)算檢測濃度結(jié)果的RSD求得，結(jié)果見表2。其中，日間RSD為2.0%～8.7%，相較于日內(nèi)RSD(0.7%～6.9%)略差，推斷是樣品中殘留蛋白沉淀導(dǎo)致待測元素濃度測量的日間變異。

2.5 人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，采用本方法對人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ClinChek?-Control Serum Control lyophilized level Ⅰ和level Ⅱ中相應(yīng)元素進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。對比測定值和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)給出的參考范圍可以看出，測定值均在給定的參考范圍內(nèi)，本方法能夠?qū)θ搜鍢悠分形⒘吭剡M(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。

2.6 人血清實(shí)際樣本檢測

本研究共采集血清樣本127例，被采血者為體檢各器官功能正常、無疾病的健康成年人。按照不同年齡段，將樣本分為21～35歲組(23例)、36～50歲組(60例)、51～65歲組(44例)，并按性別將36～50歲組(60例)分為兩組，其中男性19例，女性41例。在優(yōu)化條件下進(jìn)樣分析，檢測結(jié)果如表4所示。人體內(nèi)部分元素含量低于定量下限，按照通用的生物學(xué)檢測和調(diào)查方法，以1/2 LOQ作為該元素的估算值。

表4 不同年齡段的健康成年人血清中微量元素含量的平均值和范圍，以及不同性別健康成年人血清中微量元素含量平均值Table 4 Mean value and range of elements concentrations in serum from healthy adults of three age groups,and mean value of elements concentrations in serum from healthy adults of different sex groups

a.μg/L,b.mg/L

Fe、Cu、Zn是對人體有益的痕量元素，并被我國的各級(jí)醫(yī)療保健單位作為人體元素檢測的常規(guī)項(xiàng)目。由表4可知，F(xiàn)e、Cu、Zn含量隨著年齡的增長呈降低的趨勢。女性血清中銅的含量略高于男性。鐵是常見的受性別影響較大的元素，女性體內(nèi)鐵含量常低于男性，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[16]。

對于Al、As、Ga、Hg、Tl等有毒有害元素，Al的含量隨著年齡的增長呈增加趨勢，說明Al在人體內(nèi)有一定的累積作用，而As、Ga、Hg和Tl在各年齡段的含量無明顯趨勢。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pb、Cd元素在女性測試者體內(nèi)含量明顯高于男性，具體成因尚未明確。

3 結(jié) 論

本文建立了直接稀釋/ICP-MS方法，用于測定人血清樣品中10種微量元素，包括有益元素(Cu、Fe、Zn)和有毒有害元素(Al、Ga、As、Cd、Hg、Tl、Pb)。實(shí)驗(yàn)中采用的直接稀釋法，較常規(guī)消解方法，大大簡化了前處理過程，縮短了樣品的分析時(shí)間，有效地避免了復(fù)雜樣品前處理帶來污染的可能[17]。同時(shí)，樣品需求量少，適用于臨床微量元素檢測。針對不同分析元素，使用混合內(nèi)標(biāo)校正，測定結(jié)果更為準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)分析了不同年齡段、不同性別的健康成年人血清樣品中的微量元素，并給出了參考均值和濃度范圍，為構(gòu)建人群微量元素大數(shù)據(jù)、探討微量元素與疾病的關(guān)系提供了一種準(zhǔn)確有效的檢測方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] Forrer R,Gautschi K,Lutz H.Biol.TraceElem.Res.,2001,80(1):77.

[2] Zhang R J,Zhou Z F,Li M J,Li Z H,Zeng L L,Ma A D.J.Instrum.Anal.(張睿佳，周枝鳳，李敏杰，李子煥，曾利蘭，馬安德.分析測試學(xué)報(bào)),2017,36(8):975-979.

[3] Cai B,Wang Y,Zhao X H,Gong Z S.Anal.Lett.,2016,50(3):1-13.

[4] Harrington J M,Young D J,Essader A S,Sumner S J,Levine K E.Biol.TraceElem.Res.,2014,160(1):132-142.

[6] Kim K,Steuerwald A J,Parsons P J,Fujimoto V Y,Browne R W,Bloom M S.J.Environ.Monit.,2011,13(9):2413-2419.

[7] Lu Y,Kippler M,Harari F,Grandér M,Palm B,Nordqvist H,Vahter M.Clin.Biochem.,2015,48(3):140-147.

[8] Goullé J P,Mahieu L,Castermant J,Neveu N,Bonneau L,Lainé G,Bouige D,Lacroix C.ForensicSci.Int.,2005,153(1):39-44.

[9] Cieslak W,Pap K,Bunch D R,Reineks E,Jackson R,Steinle R,Wang S.Clin.Biochem.,2013,46(3):266-270.

[10] Ivanenko N B,Ivanenko A A,Solovev N D,Zeimal A E,Navolotskii D V,Drobyshev E J.Talanta,2013,116:764-769.

[11] Giakisikli G,Quezada A A,Tanaka J,Anthemidis A N,Murakami H,Teshima N,Sakai T.Anal.Sci.,2015,31(5):383-389.

[12] Zaichick V,Zaichick S.OpenJ.Biochem.,2014,1(2):16-33.

[13] Chen Y,Li M,Fu L,Hou X D,Jiang X M.Microchem.J.,2014,114:182-186.

[14] Pemmer B,Roschger A,Wastl A,Hofstaetter J G,Wobrauschek P,Simon R,Thaler H W,Roschger P,Klaushofer K,Streli C.Bone,2013,57(1):184-193.

[16] Zacharski,Leo R,Ornstein D L,Woloshin S,Schwartz L M.Am.HeartJ.,2000,140(1):98-104.

[17] Liu W,Song J M,Yuan H M,Li X G,Li N,Duan L Q.J.Instrum.Anal.(劉偉,宋金明,袁華茂,李學(xué)剛,李寧,段麗琴.分析測試學(xué)報(bào)),2017,36(4):471-477.