管捷程堅(jiān)謝幼專*盧建熙

骨損傷會(huì)顯著降低患者的生活質(zhì)量，骨植入物對(duì)于骨骼的修復(fù)至關(guān)重要。自體骨移植因其具有良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性而作為骨缺損植入的金標(biāo)準(zhǔn)[1,2]。然而，由于自體骨供應(yīng)短缺和供體部位并發(fā)癥，自體骨在臨床上的應(yīng)用仍是有限的[3]。在此基礎(chǔ)上，人工骨替代材料引起了人們的極大關(guān)注。其中，-磷酸三鈣（ -TCP）生物陶瓷具有與無(wú)機(jī)骨相似的化學(xué)組成，在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)能力，在體內(nèi)具有一定的降解能力，被越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于骨科領(lǐng)域[4,5]。然而，骨科植入物感染是導(dǎo)致骨科手術(shù)失敗的重要原因之一，且在本身存在活動(dòng)性骨髓炎感染時(shí)，骨植入物因存在植入新感染灶的風(fēng)險(xiǎn)而被禁止使用[6-8]。因此，如何增強(qiáng)植入材料的抗菌性成為了骨組織工程材料研究的重要課題。

近年來(lái)，納米銀作為一種良好的殺菌劑而引起了研究者們的廣泛關(guān)注。因其具有廣譜抗菌性，即對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有良好的殺菌效果[9]，且體內(nèi)研究表明，低劑量納米銀對(duì)微生物高毒性而對(duì)哺乳動(dòng)物毒性較低[10,11]。Zhong等[12]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合2%納米銀（v/v）的乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）支架，可控制耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌引起的骨感染，并促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)。

本組在前期研究中，合成了一種含5%納米銀的多孔 -TCP復(fù)合支架（ -TCP-Ag）。在近期研究工作中，建立了骨缺損的兔骨髓炎模型，并對(duì) -TCP-Ag進(jìn)行了體內(nèi)外研究。

1 材料與方法

1.1 材料制備

首先定量稱取作為造孔劑的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）顆粒0.2 g，均勻倒入模具腔內(nèi)，加丙酮固定15 min后用蒸餾水沖洗，使模具內(nèi)PMMA固定成形；將65 g的 -TCP粉末溶解至100 g去離子水中制成 -TCP勻漿；再將 -TCP勻漿分成兩組，一組不加納米銀粉，一組加入1.71 g納米銀粉顆粒。然后將各勻漿倒入模具中，分別制成100%-TCP支架胚體和含5%納米銀顆粒的 -TCP支架胚體（ -TCP-Ag）。

胚體首先通過(guò)60℃，12 h干燥，以5℃/min升溫至220℃保溫16 h，再以0.5℃/min升溫至260℃保溫7 h,然后用LHT6/120氣化爐以0.5℃/min升溫至290℃保溫30 min使有機(jī)物氣化消除。隨后在LH120/14-P300燒結(jié)爐內(nèi),以5℃/min升溫至燒結(jié)溫度1100℃，保溫3 h。燒結(jié)后納米銀變成納米氧化銀顆粒，制備得到見(jiàn)圖1所示的6 mm×12 mm含5%納米銀 -磷酸三鈣支架（ -TCP-Ag）和6 mm×12 mm純的 -磷酸三鈣支架（ -TCP），封裝后用環(huán)氧乙烷消毒保存。

圖1，支架材料實(shí)物圖：左側(cè)為100%-TCP支架，右側(cè)為含5%納米銀的 -TCP支架。

1.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）分離和培養(yǎng)

將Sprague Dawley大鼠用頸椎脫臼法處死后放入75%乙醇溶液中消毒15 min。分離雙側(cè)股骨，注意股骨周圍的肌肉組織應(yīng)完全分離，并將骨膜剝離以減少成纖維細(xì)胞的污染。離斷股骨兩端，將骨髓沖洗至含90%培養(yǎng)基和10%胎牛血清的組織培養(yǎng)液中，并裝于10 cm直徑的培養(yǎng)皿中。每隔2天換一次組織培養(yǎng)液，用光學(xué)顯微鏡觀察是否有雜細(xì)胞，待細(xì)胞80%近匯合后傳代培養(yǎng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用rBMSCs均為第三至第五代細(xì)胞。

1.3 材料浸提液制備

將 -TCP-Ag和 -TCP分別放入200 mL組織培養(yǎng)液中在37℃下浸泡72 h后過(guò)濾，制備得到兩種浸提液。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

制備rBMSCs濃度為1×105個(gè)/mL的浸提液細(xì)胞懸液和組織培養(yǎng)液細(xì)胞懸液 (作為空白對(duì)照組)加入96孔板中，每孔加100 L，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、3、5和7天，每 2天換浸提液，各時(shí)間點(diǎn)每孔加入 10 L Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下各孔OD值。

1.5 兔股骨骨髓炎模型建立

選取2.5 kg～3.0 kg的新西蘭雄兔28只，購(gòu)置于上海甲干生物科技有限公司，許可證號(hào)：SYXK（滬）2013-0087，本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批同意，倫理號(hào)：HKDL [2017]291。用臨時(shí)配置的2.5%硫賁妥鈉0.6 mL/kg肌肉注射麻醉，術(shù)中必要時(shí)耳緣靜脈追加用藥0.1 mL/kg維持良好的麻醉狀態(tài)。麻醉后取仰臥位，將左膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，聚維酮碘消毒，鋪巾。取左髕外側(cè)縱切口，長(zhǎng)約2 cm切開(kāi)皮膚、皮下，顯露股骨遠(yuǎn)端外上髁，用電動(dòng)磨鉆鉆取直徑3.5 mm的孔，實(shí)驗(yàn)組（24只）于孔內(nèi)注入1×107CFU/mL金黃色葡萄球菌0.1 mL及0.1 mL 5%魚肝油酸鈉[13]（見(jiàn)圖2A，彩圖見(jiàn)插頁(yè)）；對(duì)照組（4只）于孔內(nèi)注入0.2 mL生理鹽水，孔洞用無(wú)菌骨蠟封閉，縫合皮膚，術(shù)后拍攝X線片。所有兔子飼養(yǎng)4周后再次拍攝X線片，此期間內(nèi)隔日測(cè)量體溫和體重。

1.6 -TCP-Ag支架植入

待4周后挑選成功建立家兔骨髓炎模型組兔子，麻醉后，取仰臥位，將左膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，聚維酮碘消毒，鋪巾。用臨時(shí)配置的2.5%硫賁妥鈉0.6 mL/kg肌肉注射麻醉，術(shù)中必要時(shí)耳緣靜脈追加用藥0.1 mL/kg維持良好的麻醉狀態(tài)。在相同部位做約2 cm切口暴露股骨外上髁后用電動(dòng)磨鉆鉆取直徑6 mm的孔，植入 -TCP-Ag和 -TCP（見(jiàn)圖2B，彩圖見(jiàn)插頁(yè)），縫合皮膚。術(shù)后分別正常飼養(yǎng)4周和12周。

圖2，A為兔股骨骨髓炎建模術(shù)中注射5%魚肝油酸鈉；B為建模后骨缺損支架植入（ -TCP）術(shù)中。

1.7 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)

支架植入術(shù)后4周用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔子，無(wú)菌條件下取手術(shù)側(cè)完整股骨標(biāo)本，樣本稱重，取支架材料區(qū)域上下1 cm的骨組織，用咬骨鉗咬成骨碎片，研缽磨碎成骨粉，按100 g骨組織加入100 mL滅菌生理鹽水的計(jì)量進(jìn)行操作，加入無(wú)菌生理鹽水后置入振蕩器上震蕩20 min，用吸管吸取0.1 mL震蕩液，做100倍稀釋，取每個(gè)稀釋后的懸液各0.1 mL涂布于水解酪蛋白胨 (MH)瓊脂平板上，再用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，24 h后計(jì)數(shù)MH平板上的金黃色葡萄球菌菌落個(gè)數(shù)。

1.8 顯微電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（Micro-CT）觀察及分析

待支架植入飼養(yǎng)12周后，用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)組（-TCP-Ag）和對(duì)照組（ -TCP）兔子，取手術(shù)側(cè)完整股骨，用含4%多聚甲醛的通用組織固定液固定，做 Micro-CT掃描觀察材料植入?yún)^(qū)域并進(jìn)行三位重建，計(jì)算骨缺損區(qū)域骨小梁體積占該區(qū)域總骨組織體積的百分比（BV/TV）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 rBMSCs的培養(yǎng)

如圖3所示分離純化后的rBMSCs，細(xì)胞狀態(tài)良好，鋪展均勻，在細(xì)胞間未見(jiàn)有明顯的成纖維細(xì)胞等貼壁雜細(xì)胞。

圖3，光學(xué)顯微鏡下分離純化后的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：A為40倍放大的光學(xué)顯微鏡下圖；B為100倍放大的光學(xué)顯微鏡下圖。

2.2 -TCP-Ag的體外毒性檢測(cè)

如圖4顯示各時(shí)間點(diǎn)，各組間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4，CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞毒性的相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)（N=4）。

2.3 兔股骨骨髓炎模型建模評(píng)價(jià)

兔股骨骨髓炎模型建模手術(shù)中，實(shí)驗(yàn)組24只兔中1只兔子因麻醉劑過(guò)量的問(wèn)題在術(shù)中死亡，統(tǒng)計(jì)分析時(shí)予以排除。術(shù)后飼養(yǎng)4周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組其余23只兔均出現(xiàn)不同程度的體溫升高，食欲減退。對(duì)照組4只兔子在手術(shù)一周后體溫恢復(fù)正常，狀態(tài)良好。見(jiàn)圖5A顯示術(shù)后兔骨髓炎模型建立的4周內(nèi)，新西蘭大白兔的體溫變化情況，手術(shù)3天后實(shí)驗(yàn)組體溫明顯高于對(duì)照組。

兔股骨骨髓炎模型建模手術(shù)4周后拍攝 X線，實(shí)驗(yàn)組23只兔子中有20只出現(xiàn)不同程度的股骨遠(yuǎn)端干骺端正常骨組織結(jié)構(gòu)破壞，可見(jiàn)死骨和新骨形成。見(jiàn)圖5B和圖5C分別顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨髓炎建模術(shù)后4周的術(shù)側(cè)股骨 X線片，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周干骺端變寬，股骨遠(yuǎn)端干骺端正常骨組織結(jié)構(gòu)破壞且有骨膜反應(yīng)。

圖5，兔股骨骨髓炎模型建模評(píng)價(jià)：A為骨髓炎建模術(shù)后1天至27天的隔日直腸溫度平均值（N=4）；B為實(shí)驗(yàn)組骨髓炎建模術(shù)后4周術(shù)側(cè)股骨遠(yuǎn)端X線片；C為對(duì)照組術(shù)后4周術(shù)側(cè)股骨遠(yuǎn)端X線片。

2.4 -TCP-Ag體內(nèi)抗菌性

如圖6顯示涂布平板法培養(yǎng)的 -TCP-Ag組MH瓊脂平板表面幾乎未見(jiàn)金黃色葡萄球菌菌落（金黃色葡萄球菌的平均相對(duì)菌落數(shù)＜5個(gè)），而 -TCP組可見(jiàn)MH瓊脂平板上存在大量的金黃色葡萄球菌菌落（金黃色葡萄球菌的平均相對(duì)菌落數(shù)＞160個(gè)）， -TCP-Ag組MH瓊脂平板表面金黃色葡萄球菌的平均相對(duì)菌落數(shù)較 -TCP組明顯減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6，骨缺損支架植入后4周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MH瓊脂平板表面金黃色葡萄球菌的平均相對(duì)菌落數(shù)（N=4），*P＜0.05。

2.5 -TCP-Ag體內(nèi)促成骨性

見(jiàn)圖7A，C（彩圖見(jiàn)插頁(yè)）顯示經(jīng)三維重建后植入支架側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨組織結(jié)構(gòu)，-TCP-Ag組股骨遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)完整，皮質(zhì)骨面光滑； -TCP組股骨遠(yuǎn)端畸形，骨皮質(zhì)連續(xù)性破壞。見(jiàn)圖7B，D（彩圖見(jiàn)插頁(yè)）顯示 -TCP-Ag組支架區(qū)域骨量較 -TCP組明顯增高。圖7E顯示支架植入12周后，-TCP-Ag組BV/TV平均值顯著高于 -TCP組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7，A為骨缺損支架植入后12周，經(jīng)三維重建后 -TCP-Ag組植入支架側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨組織結(jié)構(gòu)；B為 -TCP-Ag組支架區(qū)域骨量；C為骨缺損支架植入后12周，經(jīng)三維重建后 -TCP組植入支架側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨組織結(jié)構(gòu)；D為 -TCP組支架區(qū)域骨量；E骨缺損支架植入后12周，骨缺損區(qū)域骨小梁體積占該區(qū)域總骨組織體積的百分比（BV/TV）（N=4），*P＜0.05。

3 討論

骨組織感染合并骨缺損是骨科臨床棘手的難題，常用的治療方法是徹底清除病灶，反復(fù)沖洗和開(kāi)窗引流待感染控制后 II期植入松質(zhì)骨或人工骨替代材料治療骨缺損，治療周期長(zhǎng)，患者病痛且費(fèi)用較高[7,14]。經(jīng)過(guò)大量的體內(nèi)外研究證明 -TCP是一種良好的骨缺損填充材料，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床治療骨缺損[4,5]，但其不具有抗菌作用，填充于感染部位后容易導(dǎo)致感染難以控制，而全身應(yīng)用抗生素往往難以在病變部位達(dá)到有效濃度，局部用藥很快被體液所稀釋及很快吸收，難以長(zhǎng)期在局部維持有效的藥物濃度，且容易產(chǎn)生耐藥，影響了效果。而低濃度的納米銀具有廣譜的抗菌性和不易耐藥的特性，且對(duì)哺乳動(dòng)物毒副作用小，是一種較為理想的殺菌劑[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)組制備了一種含5%納米銀的 -TCP復(fù)合支架。首先，本實(shí)驗(yàn)組在體外研究了其生物相容性，體外毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖4）， -TCP-Ag制備的浸提液組和對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)明顯差異，表明含5%納米銀的-TCP復(fù)合支架對(duì)rBMSCs未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性，即 -TCPAg具有良好的生物相容性。

本實(shí)驗(yàn)組采用 Norden等人[16]的方法，即采用金黃色葡萄球菌（ATCC25923）嘗試建立了家兔股骨骨髓炎模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)組23只兔均出現(xiàn)不同程度的體溫升高，食欲減退。對(duì)照組4只兔子在手術(shù)一周后體溫恢復(fù)正常，狀態(tài)良好。兔股骨骨髓炎模型建模手術(shù)4周后拍攝 X線，實(shí)驗(yàn)組23只兔子中有20只出現(xiàn)不同程度的股骨遠(yuǎn)端干骺端正常骨組織結(jié)構(gòu)破壞，可見(jiàn)死骨和新骨形成。經(jīng)4周飼養(yǎng)后，如圖3-4所示的體溫測(cè)量和X線表現(xiàn)表明兔股骨骨髓炎模型已成功建立（見(jiàn)圖6），經(jīng)4周飼養(yǎng)后兔股骨骨髓炎模型已成功建立，骨髓炎建模成功率約為87%，這為后續(xù)材料植入驗(yàn)證 -TCP-Ag在體內(nèi)治療骨髓炎和促進(jìn)成骨的作用提供了先決條件。Micro-CT三維重建后可見(jiàn)（見(jiàn)圖7E）骨髓炎建模植入材料后12周時(shí)，-TCP-Ag組材料周圍的骨小梁比率較 -TCP組更高。見(jiàn)圖6顯示材料植入后飼養(yǎng)4周，-TCP-Ag組內(nèi)的骨髓炎病灶已基本得到控制，材料周圍的金黃色葡萄球菌已基本被殺滅，從而通過(guò)多孔 -TCP支架促進(jìn)骨長(zhǎng)入，促進(jìn)缺損部位的骨愈合。

近年來(lái)，許多研究人員針對(duì)納米銀顆粒的抗菌機(jī)理進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)納米銀顆?？赏ㄟ^(guò)多種途徑抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。部分研究認(rèn)為，納米銀顆粒在生物活性溶液中可釋放Ag+發(fā)揮抗菌作用并誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（ROS）進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)，從而抑制細(xì)菌的呼吸鏈，引起細(xì)菌凋亡[17,18]。Sharma等[19]研究表明納米銀顆粒對(duì)多數(shù)細(xì)菌的抗菌性強(qiáng)于微米銀和Ag+，并歸因于小尺寸效應(yīng)引起的表面電子結(jié)構(gòu)特異性的改變可破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[18,20]。

綜上所述，-TCP-Ag在體外表現(xiàn)出良好的生物相容性，在體內(nèi)可有效控制植入物處骨感染的感染病灶，從而促進(jìn)骨感染的治療和骨缺損的愈合，為感染或潛在感染骨缺損的治療提供新手段，是一種極具潛力的抗菌性骨缺損植入材料。但是，本實(shí)驗(yàn)尚存在一些不足之處，如體內(nèi)的生物毒性實(shí)驗(yàn)未做進(jìn)一步的研究，且納米銀在體內(nèi)釋放的規(guī)律尚不明確，這些問(wèn)題將在接下來(lái)的研究工作中逐步完善，從而為含納米銀顆粒的多孔 -磷酸三鈣支架提供的應(yīng)用提供更為完整的科學(xué)依據(jù)。

[1] Kamitakahara M,Tatsukawa E,Shibata Y,et al.Effect of silicate incorporation on in vivo responses of-tricalcium phosphate ceramics[J].Journal of Materials Science Materials in Medicine,2016,27(5):97.

[2] Rentsch C,Rentsch B,Scharnweber D,et al.Knochenersatz[J].Der Unfallchirurg,2012,115(10):938-949.

[3] Dimitriou R,Mataliotakis GI,Angoules AG,et al.Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA:a systematic review[J].Injury-international Journal of the Care of the Injured,2011,42 Suppl 2(5):S3-S15.

[4] Bauer TW,Muschler GF.Bone graft materials.An overview of the basic science[J].Clinical Orthopaedics&Related Research,2000,371(371):10.

[5] Shepherd JH,Best SM.Calcium phosphate scaffolds for bone repair[J].JOM,2011,63(4):83-92.

[6] Wagner C,Obst U,H?nsch GM.Implant-associated posttraumatic osteomyelitis:collateral damage by local host defense?[J].International Journal of Artificial Organs,2005,28(11):1172.

[7] Verhelle N,Van ZD,Liboutton L,et al.How to deal with bone exposure and osteomyelitis:an overview[J].Acta Orthopaedica Belgica,2003,69(6):481-494.

[8] Aidan H,Heppert VG,Suda AJ.Osteomyelitis[J].Archives of Orthopaedic&Trauma Surgery,2013,133(9):1183-1196.

[9]Yamanaka M,Hara K,Kudo J.Bactericidal Actions of a Silver Ion Solution on Escherichia coli,Studied by Energy-Filtering Transmission Electron Microscopy and Proteomic Analysis[J].Applied&Environmental Microbiology,2005,71(11):7589-7593.

[10]Taglietti A,Arciola CR,D'Agostino A,et al.Antibiofilm activity of a monolayer of silver nanoparticles anchored to an amino-silanized glass surface[J].Biomaterials,2014,35(6):1779-1788.

[11]Zhao L,Wang H,Huo K,et al.Antibacterial nano-structured titania coating incorporated with silver nanoparticles[J].Biomaterials,2011,32(24):5706-5716.

[12]Zheng Z,Yin W,Zara JN,et al.The use of BMP-2 coupled-Nanosilver-PLGA composite grafts to induce bone repair in grossly infected segmental defects[J].Oral&Craniofacial Tissue Engineering,2010,31(35):9293-9300.

[13]魯嘉良，徐鵬，劉志勇，等.骨髓炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11(34):154-157.

[14]Li Y,Liu L,Wan P,et al.Biodegradable Mg-Cu alloy implants with antibacterial activity for the treatment of osteomyelitis:In vitro and in vivo evaluations[J].Biomaterials,2016,106:250-263.

[15]You C,Han C,Wang X,et al.The progress of silver nanoparticles in the antibacterial mechanism,clinical application and cytotoxicity[J].Molecular Biology Reports,2012,39(9):9193-9201.

[16]Norden CW.Experimental osteomyelitis.I.A description of the model[J].Journal of Infectious Diseases,1970,122(5):410.

[17]Taylor PL,Omotoso O,Wiskel JB,et al.Impact of heat on nanocrystalline silver dressings.Part II:Physical properties[J].Biomaterials,2005,26(35):7230-7240.

[18]吳宗山，胡海洋，任藝，等.納米銀的抗菌機(jī)理研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2015，34(5):1349-1356.

[19]Sharma VK,Yngard RA,Lin Y.Silver nanoparticles:green synthesis and their antimicrobial activities[J].Advances in Colloid&Interface Science,2009,145(1-2):83-96.

[20]Silver S.Bacterial silver resistance:molecular biology and uses and misuses of silver compounds[J].Fems Microbiology Reviews,2003,27(2-3):341-353.