◎ 丁永霞

（菏澤市疾病預(yù)防控制中心，山東 菏澤 274010）

天然黑色素廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，是由吲哚或酚類化合物聚合而成的非均質(zhì)高分子化合 物[1]。黑色素分為吲哚型黑色素和兒茶酚型黑色素（一種植物黑色素，也稱異黑色素，呈棕色或黑色），而吲哚型黑色素又分真黑色素（如酪氨酸、二羥基苯丙氨酸、酪胺等含氮化合物）和脫黑色素（含硫大分子，如半光氨酸）。

天然黑色素是黑米、黑芝麻等黑色食品的主要活性成分，具有清除自由基、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)造血功能、調(diào)節(jié)血脂等特性[2]，以及滋補(bǔ)保健作用，是食品著色、護(hù)發(fā)與護(hù)膚的保健品所用黑色素的重要來(lái)源[3]。因此，黑色素在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

黑色素既可以通過(guò)酪氨酸或其衍生物的氧化進(jìn)行化學(xué)合成，也可以從動(dòng)植物材料中提取，還可以利用微生物合成[4]。由于合成色素在代謝過(guò)程中常會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，直接危害人體健康，所以，人們的關(guān)注點(diǎn)已從合成色素轉(zhuǎn)移到如何提取天然色素以及天然色素的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用上來(lái)。而傳統(tǒng)的提取方法，如粉碎法、壓榨法、有機(jī)溶劑提取法、回流法等存在著提取時(shí)間長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、原料預(yù)處理能耗高、熱敏性組分易被破壞、生產(chǎn)的色素產(chǎn)品純度差、有異味和溶劑殘留等缺點(diǎn)，直接影響了天然色素的發(fā)展及應(yīng)用[5]。

本實(shí)驗(yàn)利用生產(chǎn)牡丹籽油的下腳料牡丹籽殼為原料，采用超聲波輔助乙醇萃取牡丹籽殼中的黑色素，提取劑用量少（料液比1 ∶9）[6]、溫度低（45 ℃）、時(shí)間短（30 min）[7-8]、黑色素產(chǎn)率高（17.63%）[9]、節(jié)能，無(wú)溶劑殘留、無(wú)污染、可避免萃取物中高溫下的熱裂化，保護(hù)了生理活性物質(zhì)的活性，并保持萃取物的天然風(fēng)味。是較先進(jìn)的提取方法，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)預(yù)處理

1.1 主要儀器

ESJ180-4電子分析天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）、KQ-600 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（河南省豫華儀器有限公司）、TU-1810 PC 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、FTIR-370 傅立葉紅外光譜儀（U.S.A NICOLET）等。

1.2 主要試劑

牡丹籽殼（購(gòu)自菏澤堯舜牡丹生物科技公司）、 1 mol·L-1NaOH 溶液、1 mol·L-1HCl 溶液、75%和95%的乙醇溶液、0.5 g 溴化鉀。

1.3 樣品的制備

將一定量的牡丹籽殼分別裝入500 mL 的干燥燒杯，把它們放置在60 ℃的干燥機(jī)中干燥2 h。待干燥結(jié)束，將其放進(jìn)粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后過(guò)80 目篩，得到牡丹籽殼粉末。

1.4 樣品的提取

1.4.1 超聲波輔助萃取

用電子分析天平稱取一定量（60.355 8 g）的牡丹籽殼粉末，放入潔凈的三角瓶中，按料液比1 ∶9 的比例加入75%的乙醇溶液，放入超聲處理器中，在溫度45 ℃、超聲波功率600 W 的條件下，超聲提取30 min。

1.4.2 抽濾分離得到黑色素粗品

用隔膜真空壓力泵抽濾分離溶劑混合物與殘?jiān)?，反?fù)提取3 次。用75%乙醇洗滌殘?jiān)? ～3 次，合并所得濾液。然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，再連接循環(huán)水式真空泵（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器需要水浴加熱至45 ℃）減壓蒸餾回收溶劑，將濃縮物置干燥機(jī)烘干得到牡丹籽殼黑色素粗品。

1.4.3 熱堿溶解、精品的制備

用濃度為1 mol·L-1的熱氫氧化鈉溶液溶解，再加入濃度為1 mol·L-1的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值，至析出沉淀，最后減壓、過(guò)濾、干燥得到牡丹籽殼黑色素的精品。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 溫度45 ℃時(shí)黑色素的產(chǎn)率表

2 實(shí)驗(yàn)測(cè)定和結(jié)果討論

2.1 黑色素的測(cè)定及定性分析

2.1.1 紫外-可見(jiàn)的測(cè)定

（1）溶液的配制。①一組。準(zhǔn)確稱取0.01 g 的黑色素精品，放入10 mL 的比色管，再加入1 mol·L-1的NaOH 溶液至刻度（10 mL），將其充分溶解，得到濃度為1 mg·mL-1的黑色素（NaOH）溶液，編號(hào)為A；依次將A 管中的溶液稀釋10 倍，分別得到濃度為 0.1 mg·mL-1（B 管）、0.01 mg·mL-1（C 管）的黑色素 （NaOH）溶液；同時(shí)，向一個(gè)空白比色管中加入 10 mL 的1 mol·L-1的NaOH 溶 液 作 為 空 白 溶 液，編號(hào)為D。②二組。準(zhǔn)確稱取0.01 g 的黑色素精品，放入10 mL 的比色管，再加入95%的乙醇溶液至刻度線 （10 mL），將其充分溶解，得到濃度為1 mg·mL-1的黑色素（乙醇）溶液，編號(hào)為①；依次將①管中的溶液稀釋10 倍，分別得到濃度為0.1 mg·mL-1（②管）、0.01 mg·mL-1（③管）的黑色素（乙醇）溶液；同時(shí)。向一個(gè)空白比色管中加入10 ml 的乙醇溶液，作為空白溶液，編號(hào)為④。

（2）光譜掃描進(jìn)行光譜分析。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)做光譜掃描測(cè)定黑色素的吸收波長(zhǎng)。將B、D比色管作為第一組，②、④比色管作為第二組，按組次的順序同時(shí)放入紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)得光譜圖形見(jiàn)圖1、圖2，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2、表3。

圖1 0.01 mg·mL-1 黑色素（NaOH）溶液光譜掃描圖譜圖

圖2 0.01 mg·mL-1 黑色素（乙醇）溶液光譜掃描圖譜圖

表2 黑色素（NaOH）溶液的吸收波長(zhǎng)及其吸光度表

表3 黑色素（乙醇）溶液的吸收波長(zhǎng)及其吸光度表

由紫外譜圖可知，黑色素的化學(xué)成分里含有N 元素，因?yàn)?N=N的吸收波長(zhǎng)在340 nm附近，而不含S元素，是因?yàn)?C=S 的吸收波長(zhǎng)在500 nm 附近，且可以推斷出其化學(xué)結(jié)構(gòu)式中含有-COOH、苯環(huán)等官能團(tuán)。

2.1.2 紅外吸收光譜的測(cè)定

用壓片法進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。將一定量的溴化鉀和黑色素精品放在105 ℃的干燥箱中烘干1 h。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g 的溴化鉀、0.005 0 g 的黑色素精品（溴化鉀99%、黑色素精品1%），將其混合放入瑪瑙研缽中進(jìn)行充分研磨，研磨后，再放入機(jī)械式半自動(dòng)壓片機(jī)進(jìn)行壓片，壓片效果為透明狀，則證明已壓片結(jié)束。

將壓好的片旋下，放入紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定，得到紅外光譜圖如圖3 所示。從紅外光譜圖3 來(lái)看實(shí)驗(yàn)制得的樣品在一定的共振區(qū)域與真黑色素有相近的吸收峰，說(shuō)明他們可能具有以下相同的結(jié)構(gòu)：①含有-OH 或-NH2，-NH（游離）的結(jié)構(gòu)。樣品在 3 379.47 cm-1附近有較強(qiáng)的吸收峰。②含有苯環(huán)外-C-H 結(jié)構(gòu)。樣品在3 009.99、2 926.32、2 854.81 cm-1附近都存在較強(qiáng)的共振吸收峰可能是指示含有苯環(huán)外-C-H 結(jié)構(gòu)的存在。③含有-C=O 結(jié)構(gòu)。樣品在1 709.87 cm-1附近的吸收指示-C=O 的伸縮振動(dòng)。④含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。樣品在1 608.25、1 512.85、1 458.81 cm-1附近都存在較強(qiáng)的共振吸收峰，可能是有苯環(huán)。

圖3 黑色素紅外掃描光譜圖

2.2 結(jié)果分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)條件的討論

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，筆者做了許多相關(guān)實(shí)驗(yàn)，研究了處理溫度、萃取時(shí)間、料液比等因素對(duì)黑色素提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表4 ～表6。

由表4 可確定，超聲萃取黑色素的最佳處理溫度為45 ℃。

由表5 可知，超聲萃取的最佳時(shí)間為30 min。

由表6 可以確定，超聲萃取選取的最佳料液比為1 ∶9。

表4 不同溫度對(duì)黑色素產(chǎn)率的影響表

表5 不同萃取時(shí)間對(duì)黑色素產(chǎn)率的影響表

表6 不同料液比對(duì)黑色素產(chǎn)率的影響表

通過(guò)反復(fù)的正交實(shí)驗(yàn)，最終確定了實(shí)驗(yàn)的最佳條件為：溫度45 ℃，萃取時(shí)間30 min，料液比1 ∶9。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)紫外和紅外的測(cè)定，可對(duì)牡丹籽殼中的黑色素做出定性分析，其屬于真黑色素的一種。因?yàn)檎婧谏睾兔摵谏刈畲蟮膮^(qū)別就是，脫黑色素的分子結(jié) 構(gòu)式中含有S 元素。由于實(shí) 驗(yàn)儀器有限，所以推斷其分子結(jié)構(gòu)式可能與 相似。

3 社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益分析

3.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用儀器的用電量的成本計(jì)算（電費(fèi)按大型工廠計(jì)算）

①高速萬(wàn)能粉碎機(jī)的電機(jī)功率0.2 kW，其工作時(shí)間為3 h，可以計(jì)算出所用的電量=0.2×3=0.6 kW·h。②電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)的額定功率6 kW，其工作時(shí)間為9 h，可以計(jì)算出所用的電量=6×9=54 KW·h。③超聲波清洗器的超聲電功率0.6 kW，其工作時(shí)間為1.5 h，可以計(jì)算出所用的電量=0.6×1.5=0.9 kW·h。④旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的額定功率1 kW，其工作時(shí)間為12 h，可以計(jì)算出所用的電量=1×12=12 kW·h。⑤循環(huán)水式真空泵的額定功率0.18 kW，其工作時(shí)間為12 h，可以計(jì)算出所用的電量=0.18×12=2.16 kW·h。

以上5 種儀器所用的總電量=0.6+54+0.9+12+2.16= 69.66 kW·h，由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還用其他儀器進(jìn)行操作，大體估算完成本實(shí)驗(yàn)所用的總電量為72 kW·h，所以應(yīng)繳納的電費(fèi)為72×1.1=79.2 元。

3.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用材料的成本計(jì)算

市面上500 mL 95%的乙醇的價(jià)格為6.5 元/瓶，而此次實(shí)驗(yàn)所用的為75%乙醇，需要自己進(jìn)行配制，可以計(jì)算出每500 mL 的75%乙醇需要約395 mL 的95%乙醇進(jìn)行配制，最后可以算出75%乙醇的單價(jià)=6.5/500×395=5.135 元，可以估算為500 mL 75%的乙醇的價(jià)格為5.5 元/瓶。本次實(shí)驗(yàn)75%乙醇的用量約2瓶（5.5×2=11 元），但其可蒸餾回收循環(huán)使用，節(jié)省了很多成本。生產(chǎn)牡丹籽油后的牡丹籽殼0.1 元/kg；加上工時(shí)等確定本次實(shí)驗(yàn)約成本為100 元，黑色素精品質(zhì)量為10.640 8 g，每產(chǎn)出1 g 黑色素，需要成本約10 元。牡丹黑色素按100 元/g 計(jì)，每克毛利潤(rùn)90 元，產(chǎn)出每噸毛利潤(rùn)9 000 萬(wàn)元。由于黑色素所應(yīng)用的領(lǐng)域較為廣泛，所以牡丹籽殼提取出的黑色素，一旦進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，將為菏澤企業(yè)帶來(lái)很高的經(jīng)濟(jì)效益。若用牡丹黑色素開(kāi)發(fā)出天然的牡丹草本潤(rùn)黑露，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白，為國(guó)家節(jié)省大量外匯，使菏澤企業(yè)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以超臨CO2萃取牡丹籽油后的牡丹籽殼為原料，利用高新技術(shù)超聲輔助提取其中的黑色素，研究了液料比、處理溫度、萃取時(shí)間等因素對(duì)黑色素提取率的影響，制定出超聲輔助提取黑色素的工藝條件，測(cè)定出其化學(xué)成分。而實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于超聲波輔助提取黑色素比常規(guī)回流溶劑用量少（料液比1 ∶9，常規(guī)回流1 ∶30）、時(shí)間短（30 min，常規(guī)回流一次需 6 ～12 h）、溫度低（45 ℃，常規(guī)回流需60 ～70 ℃）、產(chǎn)率高（精品產(chǎn)率大于5.0%，常規(guī)回流只有1.4%，因溫度高黑色素易被氧化）、設(shè)備投資少。因牡丹籽承載神州七號(hào)飛船后，是唯一不發(fā)生變異的種子，說(shuō)明其殼對(duì)于紫外線的吸收強(qiáng)，抗輻射能力強(qiáng)。通過(guò)紫外吸收光譜分析，其含有的青花芍藥苷在280 ～360 nm有強(qiáng)的吸收。所以黑色素的研究領(lǐng)域存在很大的潛力，一旦牡丹籽殼黑色素投放市場(chǎng)，會(huì)受到社會(huì)上很多企業(yè)的青睞。