劉佳 閆昭芫 鄭思彤 甘力 柴惠★

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）致心血管疾病占當代城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，嚴重威脅人類的生活質(zhì)量，縮短預期壽命［1］。近年來，隨著納米顆粒生物學效應和安全性研究的不斷深入，納米顆粒與藥物結(jié)合用于疾病的治療被認為是可行的［2］，心血管系統(tǒng)也逐漸被認為是納米材料與藥物接合作用有效應靶點之一［3］。姜黃素是從姜科植物根莖中提取的酚性物質(zhì)，目前研究表明姜黃素在體外良好的抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用。是一種已證實具有療效的傳統(tǒng)中藥［4］。但因姜黃素極性小難溶于水、生物半衰期短、穩(wěn)定性差、代謝消除速率快的特點，導致在臨床上應用受到限制［5］。本實驗利用脂質(zhì)體作為納米材料包被姜黃素。脂質(zhì)體的體內(nèi)代謝產(chǎn)物為大豆卵磷脂，在臨床上已證實其大劑量安全性［6］。本研究旨在觀察姜黃素納米新劑型對ICAM-1的表達以及NO生成有無影響，進一步豐富其在抗動脈粥樣硬化中的藥理使用方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 HUVEC細胞購自中國科學院細胞庫、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；PBS溶液、胰酶-EDTA（均購自吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；TNF-α、大豆卵磷脂、膽固醇（均購自美國Sigma公司）；MTT 染料（上海拜力生物科技有限公司）；NO試劑盒、ICAM-1 ELISA試劑盒（均購自南京建成生物工程研究所）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Ferments公司）、PCR marker（日本Takara公司）。PCR儀（美國Bio-Rad公司，CFX96Touch）； 680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥劑制備 采用薄膜-超聲法制備。精密稱取大豆卵磷脂和膽固醇，以一定的比例混勻加入具塞三角瓶中，加入15ml氯仿使其溶解，隨后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀氯仿蒸發(fā)，可逐漸觀察到瓶壁內(nèi)形成的一層均勻脂膜。繼續(xù)干燥，待氯仿全部揮發(fā)，加入15ml乙醚溶解脂膜。隨后加入含姜黃素的乙醇溶液5ml，于恒溫振蕩器內(nèi)充分振蕩混合，借助超聲儀上超聲成油包水型乳劑。靜置30min后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)去除有機溶劑，可觀察到瓶壁上形成的凝膠，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使凝膠脫落。最后，加入pH6.8的PBS溶液50 ml使凝膠溶脹，即得到脂質(zhì)體的混懸液。一切操作之前所有器材均照射紫外光30min，結(jié)束操作后姜黃素脂質(zhì)納米粒經(jīng)0.45μm濾菌器過濾，4℃冰箱保存。

1.3 細胞培養(yǎng) 設定培養(yǎng)箱溫度恒溫37℃、5% CO2和95%空氣飽和濕度。將第6代HUVEC穩(wěn)定細胞株接種至6孔板，添加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，待細胞密度達75%～85%時，換成含0.5% FBS的DMEM饑餓培養(yǎng)8h后加藥處理。細胞分成6 組：空白對照組（正常生長，不用任何藥物處理）、TNF-α模型組（加入10μg/L TNF-α培養(yǎng)6h）、納米結(jié)構脂質(zhì)載體空藥物組（用不含藥物的納米空顆粒30μg/ml預處理1h后，再直接與1μg/L TNF-α反應6h）、TNF-α+不同濃度姜黃素納米顆粒藥物組3組（5mg/L、15mg/L、30mg/L，分別預處理1h后再加入10μg/L TNF-α共培養(yǎng) 6h）。

1.4 MTT法檢測姜黃素脂質(zhì)納米粒對HUVEC細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的HUVEC 細胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，反復吹打后將細胞接種于96孔板，每孔容積200μl，待細胞融合至70%～80%時，換為無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，使細胞生長同步于G0/G1 期，作用時間分別為6h，12h，24h，每孔加入5mg/L MTT溶液20μl，4h后吸棄上清液，每孔加入DMSO 200μl溶解結(jié)晶物，振蕩10min。在酶標儀490 nm 處測定各孔的吸光值（OD 值）。并按照以下公式計算各組細胞生存率。

1.5 實時熒光定量PCR 用Trazol法提取各組細胞RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用實時定量PCR儀器檢測基因表達量。使用96孔板，每組設立至少三個平行重復樣。每孔為20μl反應體系， 包 含 ：SYBR Fast qPCR Mix（2X），10μl；PCR Forward Primer（10μm），0.8μl；PCR Reverse Primer（10μM），0.8μl；DNA 模 板，2μl；ddH2O，6.4μl。反應條件：95℃，5min；95℃，20s；55℃，30s；72℃，10min，共35個循環(huán)，最后72℃反應10min。每個樣品按相同條件重復3次，與內(nèi)參GAPDH均一化消除實驗誤差后取平均值。引物由上海生工生物工程公司合成，如下表：

eNOS 引物序列

1.6 ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)液上清中ICAM-1的蛋白水平 各組按不同藥物處理后，細胞用無菌預冷PBS漂洗3次，分別加入100μl 80%乙醇，使乙醇均勻分布在每孔孵育10min以固定細胞；再經(jīng)PBS洗滌后，3% BSA室溫封閉1h；加入ICAM-1抗體50μl（稀釋倍數(shù)：1：500），于37℃室溫孵育 1h；TBST洗滌10min 重復3次，孵育二抗。加入顯色劑100μl，37℃避光15min，加入終止液終止反應，用酶標儀于490nm處讀取吸光值。

1.7 檢測血清NO含量 吸取細胞培養(yǎng)上清液，采用偶氮化合物硝酸還原酶法測定細胞上清液中NO含量。NO在氧氣和水存在條件下生成硝酸鹽與亞硝酸鹽，后二者在硝酸鹽顯色劑作用呈淡紅色，通過比色法得到NO含量。（參照南京建成生物工程研究所提供的NO試劑盒使用說明書）。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 藥劑制備 與純水比較姜黃素脂質(zhì)納米粒劑型澄清透明，無任何沉淀。透射電子顯微鏡下納米結(jié)構粒徑約為150～200nm。制劑成功。

2.2 MTT法檢測不同濃度姜黃素脂質(zhì)納米粒對細胞存活率的影響 見表1。

表1 不同濃度藥物處理對細胞存活率的影響

2.3 不同藥物處理組對HUVEC細胞ICAM-1 mRNA的表達 與空白對照組比較，模型組TNF-α顯著促進ICAM-1表達（P＜0.01），而姜黃素納米結(jié)構脂質(zhì)載體可顯著抑制由其誘導的ICAM-1表達量增加（P＜0.01）。

2.4 eNOS的基因表達 結(jié)果顯示，比較較于空白對照組，模型組TNF-α顯著降低eNOS表達（P＜0.01），而姜黃素納米結(jié)構脂質(zhì)載體可顯著升高由其誘導的eNOS 表達量增加（P＜0.01）。

2.5 Elisa 不同濃度姜黃素脂質(zhì)納米粒對HUVEC細胞ICAM-1分泌的影響 見表2。

表2 不同藥物處理組對HUVEC細的ICAM-1表達量

2.6 NO表達量 與空白對照組比較，模型組在TNF-α作用下，NO表達量明顯下降（P＜0.01）。而姜黃素納米結(jié)構脂質(zhì)載體可促進細胞分泌的NO的增加（P＜0.01）。

3 討論

納米材料是三維空間尺寸至少有一維處于納米量級（1～100nm）的材料。這些合成的顆粒（一般是來自于聚合物，脂質(zhì)或金屬），這些小顆粒物能夠與治療藥物偶聯(lián)在體內(nèi)進行運輸，從而運送至指定部位并得到富集［7］。其可降解的外殼可以幫助藥物在到達指定部位后緩釋［8］。同時，血管內(nèi)皮細胞作為致密的組織屏障，其本身生理學作用決定其對外界物質(zhì)吸收率低。納米載體使得藥物靶向并有助于隨后的滲透進入或穿過內(nèi)皮，提供由它們的非靶向?qū)餆o法實現(xiàn)的治療效果。姜黃素脂質(zhì)體納米顆粒的優(yōu)勢在于改變難溶藥物因極性原因難以到達病灶發(fā)揮藥效的缺點。

一氧化氮合酶（eNOS）功能障礙與AS發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系，起到根本性作用。隨著動脈粥樣硬化病情逐漸發(fā)展，內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮細胞釋放的具有血管松弛作用和抗AS的主要分子NO合成和釋放減少，內(nèi)皮細胞表面表達的粘附分子與流經(jīng)血液中的各型白細胞結(jié)合，釋放水解酶、細胞因子等促使炎癥細胞進入血管上皮層內(nèi)，引發(fā)炎癥反應發(fā)生、斑塊進一步生長，加重病情。NO能夠起到血管擴張作用，調(diào)控血小板聚集、單核巨噬細胞浸潤以及血管平滑肌細胞增殖等，對AS的發(fā)展過程中起到負性調(diào)節(jié)作用，具有積極生理意義。本實驗證明，姜黃素脂質(zhì)納米粒對于TNF-α引發(fā)的炎癥損傷作用下細胞分泌NO是有積極作用的。

同時，粘附分子表達量的降低，促使單核細胞向血管內(nèi)膜轉(zhuǎn)移是動脈粥樣硬化病變的早期階段。ICAM-1（CD54）屬于免疫球蛋白超家族粘附分子，是一種單鏈跨膜糖蛋白，在白細胞與血管內(nèi)皮細胞穩(wěn)定粘附中發(fā)揮重要作用。若在炎癥環(huán)境中內(nèi)皮細胞表達量上升，則血管內(nèi)皮細胞進一步向血管周圍浸潤，組織的炎癥和相應的損害逐步加重。本實驗結(jié)果表明，新劑型通過影響對血管內(nèi)皮細胞粘附分子的分泌抑制病情的惡化，發(fā)揮藥用作用。

［1］ Benjamin Emelia J, Blaha Michael J, Chiuve Stephanie E, et al．Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association． Circulation, 2017: e1-e458．

［2］ Buxton Denis B． Nanomedicine for the management of lung and blood diseases． Nanomedicine (Lond), 2009, 4(3): 331-339．

［3］ Cheraghi Mostafa, Negahdari Babak, Daraee Hadis, et al． Heart targeted nanoliposomal/nanoparticles drug delivery: An updated review． Biomed． Pharmacother, 2016, 86: 316-323．

［4］ Dadkhah Tehrani Abbas, Parsamanesh Masoumeh． Preparation,characterization and drug delivery study of a novel nanobiopolymeric multidrug delivery system． Mater． Sci． Eng． C． Mater． Biol． Appl,2017, 73: 516-524．

［5］ Rachmawati H, SI Surya, KN Fisheri, et al． In Vitro Study on Antihypertensive and Antihypercholesterolemic Effects of a Curcumin Nanoemulsion． Sci Pharm, 2016, 84(1): 131-140．

［6］ Zheng Y, Stephan MT, Gai SA, Abraham W, Shearer A, Irvine DJ．In vivo targeting of adoptively transferred T-cells with antibodyand cytokine-conjugated liposomes． J． Control Release, 2013,172(2): 426-435．

［7］ H Rachmawati, DK Budiputra, R MauludinBudiputra． Curcumin nanoemulsion for transdermal application: formulation and evaluation． Drug Dev Ind Pharm, 2015, 41(4): 560-566．

［8］ Von Roemeling C, Jiang W, Chan CK, et al． Breaking Down the Barriers to Precision Cancer Nanomedicine． Trends in biotechnology, 2016: e1-e12．