梁寒峭， 陳建國， 張 露，　程 池

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京100015）

已有研究表明多酚類物質(zhì)是諾麗植物中重要的活性成分，在發(fā)酵果汁中的質(zhì)量濃度可達(dá)1.14 mg/mL[5]。目前從諾麗果實、根、莖和葉中分離得到酚類化合物主要有黃酮類、香豆素類、木脂素類和酚酸類，其中香豆素是一類具有抗腫瘤，抗炎，抗病毒，保肝及抑制血小板活化因子（PAF）等生理活性的成分[6]。研究報道從諾麗果實中分離得到香豆素類成分如東莨菪亭（scopoletin）、異東莨菪亭（isoscopoletin）、東莨菪苷（scopolin）對脂肪氧合酶和低密度脂蛋白氧化反應(yīng)具有明顯地抑制作用，并且對黑色素的生成也具有抑制活性[7-9]，此外從諾麗葉中也分離得到了香豆素類成分pteryxin和peucedanocoumarin III[10]，但目前仍未見諾麗發(fā)酵果汁中香豆素成分含量的文獻(xiàn)報道。因此本研究建立了香豆素成分含量的測定方法，并對不同發(fā)酵時間的諾麗果汁樣品進(jìn)行了含量的測定與比較。

1　材料與方法

1.1　儀器與材料

UNICO-JV2000紫外分光光度計，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品：AB204-N萬分之一電子天平，瑞士梅特勒儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，METTLER-TOLEDO公司產(chǎn)品；離心機(jī)，Eppendorff公司產(chǎn)品。

諾麗發(fā)酵果汁由海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司提供；東莨菪內(nèi)酯對照品由北京盈澤納新化工技術(shù)研究院提供（批號14081804），甲醇、乙醇等其它試劑均為分析純，北京化工廠生產(chǎn)。

1.2　樣品溶液的制備

精密量取樣品10.0 mL，置于100 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密移取31.25 mL置于100 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻離心，上清液即得樣品溶液。

1.3　對照品溶液的制備

精密稱取東莨菪內(nèi)酯（scopoletin）對照品11.20 mg置于50 mL的容量瓶中，用甲醇溶解，制成母液。精密移取3 mL母液置于10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2　結(jié)果與討論

2.1　測定波長的選擇

吸取對照品溶液和樣品溶液在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1　對照品溶液吸收光譜Fig.1　Absorption spectrum of reference

圖2　樣品溶液吸收光譜Fig.2　Absorption spectrum of sample

由上圖可知，對照品溶液和樣品溶液在348 nm處都有最大吸收峰，因此確定348 nm為測定波長。

（1）將配置好的黑色橡膠混合料運至攤鋪區(qū)域，開始人工攤鋪，控制好攤鋪速度，以確保塑膠面層的密實度和平整度，將攪拌好的黑色橡膠顆粒用送料車送到鋪設(shè)地點，用刮尺攤鋪，均勻攤平。

2.2　線性關(guān)系考察

精密吸取東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 分別置于 10 mL 的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，在348 nm處進(jìn)行測定，并以吸光度（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.067 7x+0.019 8（r=0.999 2），結(jié)果表明對照品在0～0.020 mg/mL具有良好的線性關(guān)系。

2.3　精密度試驗

取1.2項下制備的樣品溶液，以甲醇為空白對照，連續(xù)6次測定其在348 nm處的吸光度，計算RSD為0.16%，表明儀器精密度良好。

2.4　重復(fù)性試驗

取1.2項下制備的樣品溶液，以甲醇為空白對照，在348 nm處測定吸光度，測得其吸光度并計算RSD值為1.88%，表明樣品的重復(fù)性良好（n=6）。

2.5　穩(wěn)定性試驗

精密吸取東莨菪內(nèi)酯對照品溶液，分別在0、10、20、40、80、120、240 min 時 348 nm 處進(jìn)行紫外測定，測得吸光度并計算RSD值為0.62%，表明對照品在240 min內(nèi)的穩(wěn)定性良好。取1.2項下制備的樣品溶液，分別在 0、10、20、40、80、120、240 min，以甲醇為空白對照，在348 nm處測定吸光度，測得其吸光度并計算RSD值為1.34%，結(jié)果表明樣品在240 min內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.6　加樣回收率的考察

精密量取1.2項下所配樣品溶液9份，各1.0 mL分別置于5 mL的容量瓶中，精密量取對照品標(biāo)準(zhǔn)液1.00 mL（0.067 2 mg），1.35 mL（0.090 7 mg），1.60 mL（0.107 5 mg）3個水平各3份加入樣品溶液中，加甲醇稀釋至刻度，并以甲醇為空白對照，在348 nm處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算平均回收率為102.44%，RSD為1.81%，結(jié)果見表1，表明該測定方法準(zhǔn)確可靠。

表1　樣品加樣回收率試驗結(jié)果Table 1　Recovery test of the samples

2.7　樣品測定

精密量取4個不同發(fā)酵時間的諾麗果汁樣品，按照1.2項下方法制備供試品溶液，以甲醇為空白對照，在348 nm處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算香豆素質(zhì)量濃度。發(fā)酵25 d至500 d的諾麗果汁中香豆素質(zhì)量濃度在17.59～24.26 mg/dL范圍內(nèi)，結(jié)果見表2。

表2　不同發(fā)酵時間諾麗果汁的香豆素質(zhì)量濃度結(jié)果Table 2　Coumarins content in Noni jucie with different fermented time

3　結(jié)語

本實驗建立的紫外分光光度法測定諾麗發(fā)酵果汁中總香豆素質(zhì)量濃度的方法簡便快捷且穩(wěn)定可靠，適用于液體類樣品中香豆素成分質(zhì)量濃度的檢測。

前期文獻(xiàn)報道諾麗植物中所含香豆素主要為吡喃型香豆素，已分離得到東莨菪內(nèi)酯、異東莨菪內(nèi)酯、東莨菪苷，東莨菪內(nèi)酯具有解熱、舒張血管和抑制PC3細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡等生理活性[11-13]，是諾麗發(fā)酵果汁中的一類重要活性物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示諾麗發(fā)酵果汁中香豆素成分的質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時間的增長變化不大，表明此類成分在發(fā)酵過程中較穩(wěn)定。本研究為后期諾麗發(fā)酵工藝的研究及相關(guān)生產(chǎn)的質(zhì)量控制奠定了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃婧婧.海巴戟果化學(xué)成分研究及藥理活性初步篩選[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2011.

[2]WANG M Y，WEST B J，JENSEN C J.Morinda citrifolia （Noni）：a literature review and recent advances in Noni research[J].Acta Pharmacol Sin，2002，23：1127-1141.

[3]HIRAZUMI A，F(xiàn)URUSAWA E，CHOU C，et al.Immunomodulation contributes to the anticancer activity of Morinda citrifolia（noni） fruit juice[J].Proc West Pharmacol.Soc,1996，39：25-27.

[4]KAMIYA K，TANAKA Y，ENDANG H，et al.Chemical constituents of Morinda citrifolia fruits inhibit copper-induced low-density lipoprotein oxidation.[J].J Agric Food Chem，2004，22；52（19）：5843-5848.

[5]CHEN Jianguo，LI Xue，LI Jinxia，et al.Determination of total polyphenol content in Xisha noni juice[J].Journal of Anhui Agri Sci，2014，42（29）：10127-10128.（in Chinese）

[6]LIN C F，NI C L，HUANG Y L，et al.Lignans and anthraquinones from the fruits of Morinda citrifolia[J].Nat Prod Res，2007，21（13）：1199-1204.

[7]SIDDIQUI S，SATTAR A，AHMAD F，et al.Isolation and structural elucidation of chemical constituents from the fruits of Morinda citrifolia Linn[J].Arch Pharm Res，2007，30（8）：919-923.

[8]BEH H K，SEOW L J，ASMAWI M Z，et al.Anti-angiogenic activity of Morinda citrifolia extracts and its chemical constituents.[J].Nat Prod Res，2012，26（16）：1492-1497

[9]DENG S，PALUK，WEST J，er al.Lipoxygenase inhibitory constituents of the fruits of noni（Morinda citrifolia） collected in Tahiti[J].Nat Prod，2007，70（5）：859-862.

[10]TAKASHIMA J，IKEDA Y，KOMIYAMA K，et al.New constituents from the leaves of Morinda citrifolia[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2007，55（2）：343-345.

[11]YANGKe，ZENGChunhui.Experimentalstudiesonantipyreticmechanismsofscpoletin[J].Chinese Journal of Drug Application and Monitoring，2006，3（27）：24-27.（in Chinese）

[12]LIU Xueli，ZHANG Liang， FU Xinlu，et al.Effect of scopoletin on PC3 cell proliferation and apoptosis[J].Acta Pharmacol Sin，2001，22（10）：929-933.（in Chinese）

[13]OLIVEIRA J，ROMERO A，SILVA S，et al.Intracellularcalcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin[J].Planta Med，2001，67（7）：605-608.