張南南 李蘭蘭 張曉昀 聞?wù)?鄒曉庭*

(1.浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058；2.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，舟山 316022)

抗生素的禁用和有效疫苗的缺乏，在一定程度上促進(jìn)了益生菌、益生元、免疫增強(qiáng)劑、植物提取物等的應(yīng)用[1]。殼寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)屬于益生元的一種，它作為自然界中唯一一種帶正電荷的堿性氨基多糖[2]，具有較好的溶解度和中性pH下的低黏度，且在胃腸道內(nèi)不易被分解，可被直接吸收入血發(fā)揮作用[3]，引起了研究人員的普遍關(guān)注。最近的研究多集中于報(bào)道COS的多種生物學(xué)效應(yīng)，包括促生長(zhǎng)、抗感染、抗腫瘤、降血壓、降低膽固醇等。研究表明，飼糧中添加COS可提高斷奶仔豬的腸道絨毛高度并降低隱窩深度，進(jìn)而提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，對(duì)仔豬的生長(zhǎng)性能有積極的改善作用[4]；進(jìn)一步研究表明，COS可提高吉富羅非魚幼魚血清中溶菌酶和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及抗嗜水氣單胞菌感染的能力，進(jìn)而對(duì)生長(zhǎng)性能和免疫性能具有一定的調(diào)節(jié)作用[5]；大量體外研究表明COS可刺激巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等細(xì)胞因子[6-8]，進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，COS是否可引起正常動(dòng)物分泌細(xì)胞因子的研究報(bào)道不多；此外，在哺乳動(dòng)物中COS的抗氧化研究多集中于妊娠后期母豬階段和仔豬階段等易發(fā)生應(yīng)激的時(shí)間段[9]，在普通時(shí)間段的研究較少。因此，本試驗(yàn)擬研究在正常生理狀態(tài)下COS對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能、免疫功能和抗氧化性能的改善作用，以期為利用COS生產(chǎn)功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用COS由浙江維豐生物科技有限公司提供，純度為99%，分子質(zhì)量為1 000 u，脫乙酰度為85%～90%，聚合度為5～10，溶于水，為黃色粉末狀固體，生產(chǎn)批號(hào)為KG-1503029。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)動(dòng)物為4周齡、體重14～16 g的雄性無特定病原體(SPF)級(jí)ICR小鼠，購買于上海萊克斯生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2002-0002。65只小鼠隨機(jī)分籠適應(yīng)1周后，選取體重均一、健康的60只小鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只。試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)試驗(yàn)組，殼寡糖劑量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/kg BW，采用灌胃的方式給藥，灌胃時(shí)以生理鹽水(NS)為溶劑將殼寡糖配成0、10、20、30、40和50 mg/mL濃度的溶液，按0.02 mL/g BW給予相應(yīng)劑量組動(dòng)物灌胃，每天定時(shí)灌胃。每周稱量1次體重，根據(jù)體重的大小來控制灌胃體積，灌胃42 d，試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于浙江大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心半封閉通風(fēng)系統(tǒng)環(huán)境，控制環(huán)境溫度在(24±1) ℃，濕度為(50±10)%，自由清潔飲水、采食(小鼠基礎(chǔ)飼糧由浙江大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，每周換2次墊料，小鼠飼養(yǎng)試驗(yàn)過程按照國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》執(zhí)行。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 體重測(cè)定

在試驗(yàn)第1天、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天和第43天清晨對(duì)每只小鼠分別進(jìn)行空腹稱重，分析體重變化。

1.3.2 免疫器官指數(shù)的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，禁食24 h(自由飲水)后稱重，每組10只小鼠全部摘眼球取血收集血液后，斷頭脫臼處死，剝離出胸腺和脾臟，稱重并計(jì)算免疫器官指數(shù)。

胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重(mg)/體重(g)；

脾臟指數(shù)(mg/g)=脾臟重(mg)/體重(g)。

1.3.3 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定

收集的每組10只小鼠的血液，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，收集血清，用以測(cè)定免疫球蛋白含量、細(xì)胞因子水平和抗氧化酶活性，每組10個(gè)重復(fù)。

1.3.3.1 血清免疫球蛋白含量的測(cè)定

血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量均采用試劑盒測(cè)定，試劑盒購自于武漢博士德生物工程有限公司，并按其說明書進(jìn)行試劑配制和指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3.2 血清細(xì)胞因子水平的測(cè)定

血清IL-6、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、IL-1β、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和TNF-α水平均采用試劑盒測(cè)定，試劑盒購自于武漢博士德生物工程有限公司，并按其說明書進(jìn)行試劑配制和指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3.3 血清抗氧化酶活性的測(cè)定

血清SOD、髓過氧化物酶(MPO)、過氧化物酶(POD)和堿性磷酸酶(AKP)活性均采用試劑盒測(cè)定，試劑盒購自于南京建成生物工程研究所，并按其說明書進(jìn)行試劑配制和指標(biāo)測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，差異顯著時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重變化

在連續(xù)灌胃COS 42 d中，各組小鼠均未出現(xiàn)任何異常反應(yīng)和死亡現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，灌胃不同劑量的COS對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)(表1)，對(duì)照組、0.2 g/kg BW COS組、0.4 g/kg BW COS組、0.6 g/kg BW COS組、0.8 g/kg BW COS組和1.0 g/kg BW COS組小鼠體重分別增長(zhǎng)了6.12、5.51、5.29、5.15、6.44、5.21 g，其中0.8 g/kg BW COS組小鼠體增重較對(duì)照組提高了5.23%，其他試驗(yàn)組體增重較對(duì)照組略有降低。

2.2 COS對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

從表2中可以看出，0.6 g/kg BW COS組胸腺指數(shù)較對(duì)照組顯著提高(P<0.05)，提高了32.87%，其他劑量組胸腺指數(shù)較對(duì)照組有所提高，但未至顯著水平(P>0.05)；灌胃不同劑量的COS對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

表1 試驗(yàn)期間各組小鼠體重變化

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。表2同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 2.

表2 COS對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

2.3 COS對(duì)小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

從表3中可以看出，隨COS灌胃劑量的增加，血清IgA、IgG和IgM含量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且都在灌胃劑量為0.6g/kg BW時(shí)達(dá)到最大值。其中，0.6 g/kg BW COS組血清IgA、IgG和IgM含量較對(duì)照組分別提高了12.14%(P<0.05)、6.89%(P>0.05)和20.69%(P<0.05)。

表3 COS對(duì)小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.4 COS對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

從表4中可以看出，灌胃不同劑量的COS對(duì)小鼠血清IL-6、IL-10、IL-1β、TGF-β和TNF-α水平均無顯著影響(P>0.05)，但各試驗(yàn)組血清IL-6、IL-1β、TGF-β水平與對(duì)照組相比總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且均在0.6 g/kg BW COS組有最小值，較對(duì)照組分別降低了6.92%、20.27%和9.34%(P>0.05)；血清IL-10水平較對(duì)照組整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在0.4 g/kg BW COS組有最大值，較對(duì)照組提高了34.00%(P>0.05)。

表4 COS對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

2.5 COS對(duì)小鼠血清抗氧化酶活性的影響

從表5中可以看出，灌胃COS具有提高小鼠血清SOD和POD活性的趨勢(shì)，其中SOD活性在0.4 g/kg BW COS組最高，與對(duì)照組相比提高了11.31%(P>0.05)，POD活性在0.8 g/kg BW COS組最高，與對(duì)照組相比提高了45.08%(P<0.05)；隨COS灌胃劑量的增加，血清MPO和AKP活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中MPO活性在0.6 g/kg BW COS組最高，與對(duì)照組相比提高了27.61%(P<0.05)，AKP活性在0.4 g/kg BW COS組最高，較對(duì)照組提高了21.30%(P>0.05)。

表5 COS對(duì)小鼠血清抗氧化酶活性的影響

3 討 論

3.1 COS對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

有關(guān)COS對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響報(bào)道不盡相同，一些研究者認(rèn)為在基礎(chǔ)飼糧中添加COS對(duì)仔豬的生長(zhǎng)性能具有促進(jìn)作用[10-11]，但喬麗紅等[12]認(rèn)為COS對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能無顯著影響，產(chǎn)生這些差異的原因可能是因?yàn)椴煌囼?yàn)所選用的COS的分子質(zhì)量和溶解度不同，也可能是因?yàn)閯?dòng)物種類及生活環(huán)境不同。從上述討論得知，COS的促生長(zhǎng)效果不穩(wěn)定，受飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生條件的影響較大。同時(shí)，在COS具有促生長(zhǎng)作用的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著COS劑量的增加，生長(zhǎng)性能并不是呈線性增加，而是有一個(gè)最佳值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)前期(第1～22天)，低灌胃劑量COS組(0.2 g/kg BW COS組)小鼠體重增加量高于對(duì)照組，中、高灌胃劑量COS組(0.6 g/kg BW COS組、0.8 g/kg BW COS組和1.0 g/kg BW COS組)體重增加量低于對(duì)照組。這表明，在0.6～0.8 g/kg BW的灌胃劑量范圍內(nèi)，COS對(duì)小鼠的生長(zhǎng)性能具有提高的趨勢(shì)，當(dāng)COS灌胃劑量至1.0 g/kg BW時(shí)，生長(zhǎng)性能反而具有降低的趨勢(shì)，這與上述研究結(jié)果類似?？梢?，COS的添加劑量有一個(gè)適宜的范圍，過量添加可能會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生不利影響，目前對(duì)COS副作用的研究尚未見報(bào)道，具體原因有待于進(jìn)一步的研究。目前研究認(rèn)為，哺乳動(dòng)物對(duì)碳水化合物的消化主要限于以α-1,4糖苷鍵連接而成的多糖，對(duì)其他形式的糖苷鍵不分解或分解能力弱，而COS是由β-1,4-糖苷鍵連接而成的，在哺乳動(dòng)物小腸內(nèi)不能被消化酶分解，直接被小腸吸收，過量添加會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物不良性腹瀉，對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)[14]。試驗(yàn)后期(第22～43天)，中、高灌胃劑量組(0.6 g/kg BW COS組、0.8 g/kg BW COS組)小鼠體重增加量高于對(duì)照組及低灌胃劑量組(0.2 g/kg BW COS組、0.4 g/kg BW COS組)，可能是試驗(yàn)后期小鼠對(duì)COS產(chǎn)生了適應(yīng)性，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 COS對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

免疫器官包括中樞免疫器官和外周免疫器官兩部分，中樞免疫器官包括骨髓和胸腺，外周免疫器官包括淋巴結(jié)、脾臟和黏膜相關(guān)淋巴組織等。胸腺是T細(xì)胞分化和發(fā)育成熟的主要場(chǎng)所，其作用是誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生成熟的免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫應(yīng)答；脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，是機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所[15]。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)可作為基本的免疫指標(biāo)直接反映機(jī)體的免疫功能[16-17]。目前認(rèn)為COS對(duì)免疫器官發(fā)育存在著一定作用，本試驗(yàn)結(jié)果顯示灌胃0.6 g/kg BW COS可顯著提高胸腺指數(shù)，灌胃0.6～0.8 g/kg BW COS對(duì)脾臟指數(shù)具有提高趨勢(shì)。鄧陽勇等[18]研究表明蘆薈多糖可使胸腺皮質(zhì)增厚，皮質(zhì)和髓質(zhì)分解明顯，淋巴細(xì)胞更密集。推測(cè)本次試驗(yàn)中0.6 g/kg BW COS組小鼠胸腺指數(shù)顯著提高的原因可能是添加COS可促進(jìn)小鼠胸腺中淋巴細(xì)胞的發(fā)育，提高胸腺中淋巴細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)而促進(jìn)免疫器官發(fā)育，提高免疫機(jī)能。

3.3 COS對(duì)小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

體外研究表明COS可以刺激巨噬細(xì)胞分泌多功能的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化，并促進(jìn)免疫球蛋白的產(chǎn)生[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示灌胃0.6 g/kg BW COS可顯著提高小鼠血清中IgA和IgM含量，推測(cè)其原因可能是COS的活性基團(tuán)直接刺激了小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)[20]。此外，免疫球蛋白是化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似或具有抗體活性的一類糖蛋白，其結(jié)構(gòu)中的大部分糖是以聚糖的形式結(jié)合形成的，聚糖有2種類型，N-乙?；肴樘呛蚇-乙酰基葡萄糖，COS可以提供N-乙?；咸烟堑臍埢?，并可以結(jié)合到具有免疫活性的存在于細(xì)胞表面的殘基受體，進(jìn)而提高免疫能力；此外，COS攜帶的正電荷可與T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面的負(fù)電荷相互吸引，激發(fā)免疫細(xì)胞向B細(xì)胞發(fā)出指令，產(chǎn)生免疫球蛋白[21]。另有研究表明，在動(dòng)物胃腸道內(nèi)寄居的乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌可以分泌打開β-1，4糖苷鍵的酶，進(jìn)而利用COS[4]。雙歧桿菌和乳酸菌利用COS可產(chǎn)生琥珀酸、乳酸、短鏈脂肪酸，降低腸道的pH，產(chǎn)生酸性的腸道環(huán)境，有利于乳酸菌的增殖[22]。腸道內(nèi)的有害菌如沙門氏菌、大腸桿菌等由于不能分泌分解COS的酶類而不能利用COS，COS可通過攜帶正電荷的游離氨基與細(xì)菌細(xì)胞壁或者細(xì)胞表面所攜帶的陰離子物質(zhì)相結(jié)合，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入或使細(xì)胞變形，進(jìn)而干擾其正常的物質(zhì)代謝，發(fā)揮抑制有害菌增殖的作用[23]。因此，COS也可能是通過促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)和抑制有害菌的生長(zhǎng)來提高免疫機(jī)能。

3.4 COS對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

作為免疫促進(jìn)劑的COS可與淋巴細(xì)胞或吞噬細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，通過與細(xì)胞因子的協(xié)同作用，有效刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答[24]，此過程中釋放的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素類、干擾素類等。有關(guān)COS對(duì)細(xì)胞因子水平的影響報(bào)道不一致，Deng等[25]研究表明COS可刺激巨噬細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6和TNF-α，從而提高肉雞的免疫力；而Walsh等[26]在斷奶仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)COS并沒有影響IL-6、IL-10、TNF-α等的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TGF-β水平與對(duì)照組相比總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，血清IL-10水平較對(duì)照組整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。COS分子結(jié)構(gòu)中含有的氨基可被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，結(jié)合到巨噬細(xì)胞表面的受體，刺激巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，同時(shí)可引起T細(xì)胞表面的白細(xì)胞介素-2(IL-2)受體的表達(dá)，加速T細(xì)胞成熟而釋放IL-2，其與受體結(jié)合后進(jìn)一步加速了T細(xì)胞的成熟和分化，刺激血液循環(huán)中抗體的產(chǎn)生[21]。賈培媛等[27]研究發(fā)現(xiàn)COS可顯著增加小鼠脾臟中CD8+T淋巴細(xì)胞的比例，而CD8+T淋巴細(xì)胞在IL-10產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要作用[28]，IL-10在體內(nèi)是免疫系統(tǒng)的中央調(diào)節(jié)器[29]，它的缺失不僅會(huì)造成小鼠結(jié)腸性炎癥，而且還可導(dǎo)致上皮滲透性炎癥[30]。本試驗(yàn)中，灌胃不同劑量COS后小鼠血清IL-10水平整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，不會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)。IL-10作為重要的抗炎性細(xì)胞因子，能過抑制活化的T細(xì)胞的產(chǎn)生過量的IL-6、IL-1β等炎性細(xì)胞因子，從而防止過度免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體造成的傷害[31]。本試驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠血清IL-6、IL-1β水平整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，不會(huì)引發(fā)過度的免疫反應(yīng)，同時(shí)這也與試驗(yàn)組小鼠血清IL-10水平的升高相吻合。本研究結(jié)果與Walsh等[26]的研究結(jié)果相符，與Deng等[25]的結(jié)果不同，因豬和小鼠同屬于哺乳動(dòng)物，而雞屬于鳥類，因而推測(cè)COS在哺乳動(dòng)物和鳥類上產(chǎn)生的效果可能不同。

3.5 COS對(duì)小鼠血清中抗氧化酶活性的影響

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，灌胃不同劑量COS對(duì)小鼠的生長(zhǎng)性能、脾臟指數(shù)以及血清IgG含量、細(xì)胞因子水平、SOD和AKP活性均無顯著影響，但灌胃劑量為0.6～0.8 g/kg BW時(shí)，小鼠脾臟指數(shù)有增加的趨勢(shì)，且胸腺指數(shù)以及血清IgA和IgM含量、MPO和POD活性均有不同程度提高。

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