董海濱，米陽，黃煌，梅璐，何曉燕，李彥偉，鄭鵬遠

1.消化內科；2.病理科，鄭州大學第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種主要定植在胃黏膜表面的革蘭陰性菌[1]。世界上約有50%人口被H.pylori感染[2]，其傳播方式主要是人與人之間的口口和糞口傳播，有明顯的家庭聚集現(xiàn)象[3]。各種流行病學顯示，H.pylori感染是胃炎、胃十二腸潰瘍、胃淋巴瘤和胃癌的主要病因[4]，并被WHO認為是一類致癌原[5]。既往研究表明，H.pylori主要作用于胃癌前期階段，即胃上皮腸化及之前階段，亦即H.pylori啟動了胃癌的發(fā)生[6]。但是H.pylori感染引起胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制一直尚未闡明，其中H.pylori感染引起胃上皮DNA損傷及修復機制是近年來研究的熱點[7]。DNA雙鏈損傷主要通過兩種方式修復，不精確的非同源重組(non-homologous end join，NHEJ)修復和精確的同源重組(homologous recombination，HR)修復[8]。研究表明，H.pylori感染可以導致胃上皮細胞DNA雙鏈斷裂，但卻抑制很多DNA修復相關基因[9]。H.pylori感染細胞帶著未經準確修復的DNA損傷，繼續(xù)增殖分裂，進入了細胞惡變進程[10]。因此，闡明H.pylori抑制DNA修復，特別是HR精確修復的分子機制是急需探討的重要問題，也是闡明胃癌癌前病變發(fā)生分子機制的重要方向。本研究中，我們將分析胃癌前期不同階段H.pylori陽性與陰性患者胃黏膜上皮組織DNA損傷標志物及HR修復通路中關鍵蛋白的表達情況，探討H.pylori在胃癌前期是通過哪些靶點抑制HR修復，揭示H.pylori在推動胃癌前期發(fā)展過程中的分子機制，從而為胃癌的早期診斷以及今后的精準治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1標本來源 鄭州大學第五附屬醫(yī)院2017年3月-9月因消化道不適癥狀行胃鏡檢查患者165例，除外心腦血管疾病、肝腎功能衰竭、胃潰瘍、胃部手術、大量吸煙飲酒史、H.pylori根除史、近2周用藥史(抗生素、質子泵抑制劑、抗腫瘤藥物等)。內鏡下取胃竇病變部位胃黏膜上皮組織，制作蠟塊。切片后行HE染色確定病理類型，其中慢性淺表性胃炎(CSG)80例、萎縮性胃炎(CAG)32例、腸上皮化生(IM)35例、不典型增生(Dys)18例。免疫組織化學方法確定H.pylori感染情況，其中H.pylori陽性患者78例，平均年齡(54.1±13.4)歲；H.pylori陰性患者87例，平均年齡(53.9±13.6)歲。所有患者均知情同意。

1.1.2實驗試劑 γH2AX抗體來自德國柏林馬克思普朗克感染生物學研究所Thomas F. Meyer教授饋贈，鼠抗MRE11多克隆抗體(ab214)購自美國Abcam公司，鼠抗Rad51多克隆抗體(MA5-14419)、兔抗CtIP多克隆抗體(PA5-20963)購自美國Thermo Fisher公司，兔抗H.pylori多克隆抗體(ZA-0127)、兔二抗試劑盒(SP-9001)、鼠二抗試劑盒(SP-9002)、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋，PBS粉劑、檸檬酸鈉抗原修復液等均購自北京雷根公司。

1.1.3實驗儀器 BMJ-B型包埋冷臺、PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)，LEICA RM2245組織切片機。

1.2方法

1.2.1組織切片 用切片機切取厚度為3 μm切片，撈片后攤片5 min，后置于烘片機內70℃烘烤1 h，留作備用。

1.2.2免疫組織化學 將上述制備好切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脫蠟各15 min，后置于無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脫苯各10 min，再置于95%、85%、75%梯度酒精水化各5 min，PBS清洗3次。檸檬酸鈉抗原修復液微波修復15 min，冷卻至室溫，PBS清洗3次。3%過氧化氫去離子水封閉內源性過氧化物酶15 min，PBS清洗3次，山羊血清封閉15 min，傾去，滴加一抗，4℃孵育過夜。次日取出，PBS清洗3次。滴加生物素化二抗37℃孵育20 min，PBS清洗3次。再滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育20 min，PBS清洗3次。DAB顯色劑顯色5 min，蒸餾水終止反應。流水清洗15 min，蘇木素復染胞核5 min，自來水充分清洗。鹽酸酒精分化5 s，流水沖洗15 min。依次置于75%、85%、95%乙醇和無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脫水各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各10 min，中性樹膠封片觀察?？瞻讓φ战M使用相同抗體稀釋液孵育過夜。

1.2.3病理結果判定與免疫組化評分 病理切片由兩名經驗豐富病理醫(yī)生讀片，結果根據悉尼標準進行判定[11]。H.pylori免疫組化在胃黏膜上皮或腺管內觀察到小短桿狀、黃褐色螺旋樣菌即為H.pylori陽性，反之為陰性。免疫組化評分采用德國半定量方法[12]，兩名病理科醫(yī)生雙盲評分平均而得。γH2AX、MRE11、Rad51、CtIP蛋白表達以胃黏膜腺管上皮細胞核呈黃至棕褐色為陽性細胞，無著色為陰性細胞。陽性細胞數(shù)評分標準：(1)陽性腺管上皮細胞數(shù)占總腺管上皮細胞數(shù)的百分比：<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；≥75%為4分。(2)染色強度以視野中多數(shù)細胞所呈現(xiàn)的染色深淺計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(3)組織得分為陽性細胞所占比例計分和染色計分乘積，再根據以下判定結果統(tǒng)計陽性表達例數(shù)進行相關性分析：0～2分陰性(-)，3～5分弱陽性(+)，6～8分中度陽性(++)，9～12分強陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計分析 所得數(shù)據采用SPSS 20.0軟件進行

統(tǒng)計學分析，等級資料多組間采用Kruskal-WallisH檢驗，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1DNA損傷標記蛋白和HR修復關鍵蛋白在胃癌前期不同階段的分布和差異 DNA損傷標記蛋白(γH2AX)和HR修復關鍵蛋白(MRE11、Rad51、CtIP)在胃黏膜組織腺管上皮細胞內的表達，以及H.pylori在胃黏膜腺管內的分布如圖1所示。4種蛋白在胃癌前期不同病理階段的表達差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 免疫組化檢測H.pylori及DNA損傷標記蛋白和HR修復關鍵蛋白的表達(×400)

2.2H.pylori在胃癌前期不同階段對DNA損傷標記蛋白和HR修復關鍵蛋白表達的影響 為進一步明確H.pylori感染在胃癌前期不同病理階段對DNA損傷標記蛋白和HR修復關鍵蛋白表達的影響，我們進一步進行統(tǒng)計分析。

2.2.1H.pylori對γH2AX表達的影響 在CSG、CAG、IM三組內，γH2AX的表達H.pylori陽性組高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(Mann-WhitneyU=1116.5，P=0.001；Mann-WhitneyU=185.0，P=0.018；Mann-WhitneyU=214.5，P=0.041)；而在Dys組內，H.pylori陽性與陰性亞組表達差異無統(tǒng)計學意義(Mann-WhitneyU=35.5，P=0.964)。見表1。

表1 H.pylori與γH2AX表達

注：CSG:慢性淺表性胃炎，CAG:慢性萎縮性胃炎，IM:腸上皮化生，Dys:異性增生。

2.2.2H.pylori對MRE11表達的影響 在CSG、CAG兩組內，MRE11表達在H.pylori陽性亞組高于陰性亞組，差異具有統(tǒng)計學意義(Mann-WhitneyU=1117.0，P=0.001；Mann-WhitneyU=201.0，P=0.002)；而在IM、Dys兩組內，H.pylori陽性與陰性亞組內表達差異無統(tǒng)計學意義(Mann-WhitneyU=171.0，P=0.568；Mann-WhitneyU=41.5，P=0.616)。見表2。

表2 H.pylori與MRE11表達

注：CSG:慢性淺表性胃炎，CAG:慢性萎縮性胃炎，IM:腸上皮化生，Dys:異性增生。

2.2.3H.pylori對Rad51表達的影響 在CSG、IM兩組內，Rad51表達在H.pylori陽性亞組內表達低于陰性亞組，差異具有統(tǒng)計學意義(Mann-WhitneyU=490.0，P=0.002；Mann-WhitneyU=73.0，P=0.007)；而在CAG、Dys兩組內，H.pylori陽性與陰性亞組內表達差異無統(tǒng)計學意義(Mann-WhitneyU=101.0，P=0.404；Mann-WhitneyU=24.0，P=0.291)。見表3。

表3 H.pylori與Rad51表達

注：CSG:慢性淺表性胃炎，CAG:慢性萎縮性胃炎，IM:腸上皮化生，Dys:異性增生。

2.2.4H.pylori對CtIP表達的影響 在CSG、IM兩組內，CtIP表達在H.pylori陽性亞組表達低于陰性亞組，差異具有統(tǒng)計學意義(Mann-WhitneyU=593.0，P=0.044；Mann-WhitneyU=58.5，P=0.001)；而在CAG、Dys兩組內，H.pylori陽性與陰性亞組內表達差異無統(tǒng)計學意義(Mann-WhitneyU=84.0，P=0.136；Mann-WhitneyU=18.5，P=0.102)。見表4。

表4 H.pylori與CtIP表達

注：CSG:慢性淺表性胃炎，CAG:慢性萎縮性胃炎，IM:腸上皮化生，Dys:異性增生。

3 討 論

3.1國內外研究進展 DNA損傷導致的基因組不穩(wěn)定性增加是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要分子機制。DNA雙鏈斷裂是DNA損傷最嚴重的一種形式，可以導致基因缺失突變，甚至染色體重排異位等嚴重后果[13]。NHEJ和HR修復是DNA雙鏈斷裂時最主要的修復方式。其中NHEJ修復是不精確修復，而HR修復是高保真的精確修復。在細胞進入S/G2期，MRE11和CtIP在HR修復早期剪切DNA斷裂末端，從而和CtIP一起以5′→3′端核酸內切酶來剪切DNA斷端，從而也去掉了結合在DNA斷裂末端的Ku70/80，抑制了NHEJ修復，開啟了HR修復模式。剪切形成的DNA斷裂端懸臂被RPA結合，然后RPA被DNA重組酶Rad51取代，形成延長的DNA單鏈螺旋絲狀體，被稱為突觸前復合體。繼而用來配對同源DNA，為后繼精確修復提供模板，開啟了HR修復[14]。因此，MRE11、CtIP開啟了HR修復通路，而Rad51處于HR修復的核心地位，三個蛋白是HR修復通路的核心蛋白。γH2AX由DSB斷點附近組蛋白H2AX磷酸化而來，通過標注DSB附近的核小體作為DNA損傷的分子標記[15]。

以往在H.pylori感染細胞系模型中的研究表明，H.pylori感染可以抑制大部分DNA修復蛋白相關基因，包括某些HR修復蛋白的基因[9]。但對臨床H.pylori感染的患者胃黏膜中DNA損傷修復蛋白的相關研究較少，或多局限于胃癌終末階段胃上皮樣本?，F(xiàn)在主流研究認為，H.pylori主要作用于胃癌前期階段，即腸化生階段之前[6]。H.pylori感染啟動了胃癌的發(fā)生。但對于H.pylori如何啟動胃癌發(fā)生的分子機制至今未解。因此，研究H.pylori在胃癌前期階段如何引起DNA損傷，以及如何抑制精確HR修復，就成了一個重要的研究方向。

3.2研究結果 本研究取自臨床胃癌前期不同階段患者胃黏膜標本，發(fā)現(xiàn)在CSG、CAG和IM階段，H.pylori陽性組較陰性組γH2AX表達增多，從臨床標本層面印證了H.pylori感染在胃腺癌前期導致胃黏膜細胞DNA雙鏈斷裂損傷。然后，進一步分析HR修復的核心蛋白，發(fā)現(xiàn)在多數(shù)胃腺癌前期病理類型中，MRE11的表達在H.pylori陽性組內高于陰性組，而Rad51和CtIP的表達H.pylori陽性組低于陰性組。由此可以推測，在臨床胃黏膜樣本中，H.pylori感染促進DSB損傷后，MRE11作為HR修復的起始蛋白，表達會增多。但是，另一個HR修復的起始蛋白CtIP表達降低。而且作為HR修復的核心蛋白Rad51也同時降低。從而勢必影響HR修復開始階段DNA斷裂末端的剪切和后期DNA同源序列的尋找，影響HR修復的順利進行。HR修復路徑的功能障礙必將造成DNA修復錯誤率的增加，從而造成基因組的不穩(wěn)定性增加。

3.3研究意義與創(chuàng)新 既往在體外細胞系和原代細胞感染模型中研究表明，H.pylori感染可以抑制大部分DNA修復基因，包括MRE11[9]，但是在我們此次體內臨床樣本研究中，卻發(fā)現(xiàn)H.pylori陽性的慢性胃炎患者胃黏膜中MRE11表達相對H.pylori陰性的上調，說明在體內條件下可能有其他混雜因素參與調控MRE11。CtIP作為HR修復關鍵蛋白，既往未見有和H.pylori相關報道，此次是我們首次開創(chuàng)性的研究。我們發(fā)現(xiàn)在淺表性胃炎和腸化階段，H.pylori陽性患者的胃黏膜標本中CtIP的表達較H.pylori陰性患者降低。CtIP作為HR修復重要起始蛋白和已知的抑癌蛋白[16]，其表達量的下降也將進一步增加了細胞的癌變風險，也揭示了H.pylori致癌機制的一個新靶點，值得我們進一步研究。因此，我們此次研究從臨床標本層面證明，H.pylori可能是通過抑制CtIP和Rad51來抑制精確的HR修復路徑，從而開啟胃上皮細胞惡變的進程。

3.4不足與展望 當然，我們的研究也存在不足，比如樣本量還不夠豐富，這可能是沒有觀察到DNA損傷及修復蛋白在胃癌前期不同病理階段有明顯差別的原因，所以和以往某些相關研究有所差別。下一步，我們將增大樣本量，并進一步分析H.pylori毒力菌株和毒力因子，以及相關的基因亞型與DNA損傷及HR修復蛋白的關系，探索H.pylori調控HR修復的具體機制，從而為臨床胃癌個體化和早期診斷，靶向治療提供理論基礎。

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