周文旭，方 堃，譚湘淑，佘 君，梁 熹 ，劉 江，蒲 丹

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安710061)，2.西安交通大學(xué)醫(yī)院(西安710049)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種臨床常見的以侵犯關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及骨為主的自身免疫病，病變過程多涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子。位于關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)層的成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-likesynoviocytes, FLS)在RA病變中異常活化，是介導(dǎo)關(guān)節(jié)局部炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞之一。有研究表明：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨和骨組織損害，與滑膜細(xì)胞的過度增生活化與凋亡不足密切相關(guān)[1]。因此抑制炎性滑膜組織增生及誘導(dǎo)滑膜組織中各種細(xì)胞凋亡是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的靶點[2-3]。

甲氨蝶吟(Methotrexate, MTX)近多年來已成為RA臨床治療的基石用藥(Anchor drug)[4]。但對于其治療RA的作用機(jī)制尚不明確。本研究采用CIA模型，觀察甲氨蝶吟對大鼠整體療效及對滑膜組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、9蛋白的表達(dá)影響，進(jìn)一步探討甲氨蝶吟治療RA的作用機(jī)制，為尋找新的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 實驗動物 SPF級健康雌性SD大鼠60只，體重(120±20)g，鼠齡4～5周，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物制品研究所提供。實驗開始前1周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，保持室內(nèi)22℃，自由攝食。

2 藥品與試劑 酸可溶性II型膠原蛋白(CII)與弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品。甲氨蝶吟片，2.5 mg購自上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠。Caspase-3，Caspase-9，Bax，Bcl-2和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)有限公司。Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；熒光定量試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。引物由Invitrogen公司合成。藥物均研磨成粉末，采用生理鹽水制成所需濃度。

3 實驗方法

3.1 動物造模與分組:選取清潔級Wistar大鼠40只，體重50～100 g，用0.1 mmol/L醋酸溶解II型膠原蛋白(2 mg/ml，4℃，過夜)，再與等量的弗氏完全佐劑混合，于冰浴中充分乳化除正常組外，每只大鼠尾根部皮下多點注射膠原蛋白0.2 mg。造模后10 d將動物隨機(jī)分為假模型組，模型組，高、中、低給藥組各8只。各組給藥量如下：高劑量給藥組30 mg/kg，中劑量給藥組3 mg/kg，低劑量給藥組0.3 mg/kg，按10 ml/kg量灌胃，每日1次，假模型組，模型組給予等量生理鹽水灌胃，1.0 g/kg，1次/d。各組連續(xù)30 d用藥。分別于致炎后第14、16、18、20、24、28天用毛細(xì)管放大測量法測右后足體積，求出腫脹增長百分率=[(給藥后值-給藥前值)/給藥前值]×100%。

3.2 滑膜細(xì)胞分離培養(yǎng):各組大鼠末次給藥后24 h，無菌操作取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，并剪成1 mm3大小后加4 m1 0.4 mg/ml的II型膠原酶(溶于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，于5% CO2條件下孵育3 h，離心收集未貼壁的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于含有15%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗用第2～4代細(xì)胞。實驗時用含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液將滑膜細(xì)胞數(shù)調(diào)整至每毫升1×106個細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。

3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：取對數(shù)生長期細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為2×105/ml，每孔接種1 ml于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，吸棄殘余培養(yǎng)基，根據(jù)造模結(jié)果選取大鼠足腫脹抑制作用最有效的藥物濃度組(3 mg/kg MTX)，與未給藥的模型組共3個組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄上清液，PBS洗滌2次，胰酶消化收集細(xì)胞，重懸于離心管中，室溫下2000 r/min離心5 min。用Loading Buffer懸浮細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，向懸液中加入5 μl AnnexinV FITC和 10μl碘化丙啶(PI)，混勻。室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次。

3.4 Caspase-3，Caspase-9，Bax，Bcl-2 蛋白表達(dá)測定:提取細(xì)胞總蛋白，后取蛋白質(zhì)樣品50 μg加緩沖液煮沸變性后，10%SDS PAGE；電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉TBS (pH 8.0)封閉2 h；加入適量Bc1-2、Bax 鼠單抗IgG (1∶400)、Caspase-3兔多抗IgG(1∶400)，搖床上室溫反應(yīng)2 h；洗膜3次，每次20 min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶6000)，室溫反應(yīng)2 h；洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，X光顯影。圖像掃描儀掃描后，用圖像分析軟件Band Scan 5.0行吸收度積分值分析，計算目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH蛋白表達(dá)量的吸收度積分值之比作為目的蛋白表達(dá)量相對含量，實驗重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型的制備 致炎各組大鼠和正常大鼠相比，毛色晦暗并輕微脫毛，精神萎靡，食量減少，體重增長減緩，尾部出現(xiàn)明顯結(jié)節(jié)，雙側(cè)后踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，造模成功，模型成功率達(dá)85%。模型組大鼠右后足在致炎后14 d出現(xiàn)腫脹，在致炎后28 d前后腫脹度達(dá)峰值見表1。與模型組比較，甲氨蝶呤顯示出劑量依賴性抑制大鼠足腫脹的作用，且模型組的足腫脹度越高，甲氨蝶呤的抑制作用越強，藥物在致炎后28 d左右抑制作用達(dá)到峰值，見圖1。其中，以高劑量最為明顯(P<0.01)，與對照組比較, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，我們選擇其進(jìn)行下面的實驗。

表1 甲氨蝶呤對Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)誘導(dǎo)大鼠足腫脹的抑制作用

圖1 甲氨蝶呤對Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)大鼠足腫脹的抑制作用

2 甲氨蝶呤對RA滑膜細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞分離后培養(yǎng)48 h經(jīng)Anziexin V/PI染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組凋亡細(xì)胞(圖2)，以右上和右下象限為凋亡細(xì)胞，統(tǒng)計各組凋亡細(xì)胞百分率。各組均能不同程度誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡，以給藥組的作用最明顯。與對照組比較，模型組和假模型組明顯誘導(dǎo)RA滑膜凋亡(P<0.05)。

3 對大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響 見圖3。高劑量甲氨蝶呤組的Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)量與模型組比較明顯上調(diào)；而與模型組相比較，Bc1-2蛋白表達(dá)量下降(P<0.01)。

假模型組 模型組 給藥組

圖3 線粒體凋亡途徑凋亡蛋白水平

討 論

RA是一種病變累及周圍關(guān)節(jié)的多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫病[5]。常因沒有早期診治，在發(fā)病兩年內(nèi)出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞，造成關(guān)節(jié)畸形以及功能喪失，最終殘疾[6]。有研究表明：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨和骨組織損害，與滑膜細(xì)胞的過度增生活化與凋亡不足密切相關(guān)[1]。因此，抑制自身免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖及促進(jìn)該免疫反應(yīng)的細(xì)胞凋亡，阻止關(guān)節(jié)滑膜中炎性細(xì)胞的浸潤可減輕關(guān)節(jié)炎病變，是治療關(guān)節(jié)炎的一條重要途徑。

甲氨喋吟是目前公認(rèn)的治療RA有效的免疫抑制劑，通過對腺苷誘導(dǎo)的免疫抑制作用、對炎性細(xì)胞增殖和凋亡的影響及對單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞因子及其抑 制因子的作用等，以及使滑膜組織金屬蛋白酶水平降低，從而發(fā)揮抗炎及免疫抑制作用[7-9]。有研究表明：許多RA患者單用MTX即可使炎癥緩解，疾病活動性得到明顯的控制，且單藥治療除了極高的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)價值外，還有相當(dāng)好的安全性。Bologna等也對服用甲氨蝶吟的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)患者的關(guān)節(jié)腫痛晨僵血沉及C-反應(yīng)蛋白的指標(biāo)在6個月左右開始顯著改善。本研究顯示：CIA大鼠造模后關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，以后肢最為明顯，在第28天達(dá)到了高峰。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，治療后，高劑量治療組肢體炎癥的腫脹程度與模型組相比均有改善。結(jié)果表明MTX的應(yīng)用對局部關(guān)節(jié)炎癥均有明顯控制作用，這與文獻(xiàn)報道相一致[10]。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)治療組滑膜細(xì)胞的凋亡幅度明顯上升，與對照組差異顯著，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠滑膜組織的Bcl-2表達(dá)增加，而Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)下降，提示滑膜細(xì)胞凋亡相關(guān)

基因表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞增生與凋亡不平衡，從而引起滑膜細(xì)胞增生。而甲氨蝶呤使從大鼠滑膜細(xì)胞Bc1-2表達(dá)減少，Caspase-3、Caspase-9、Bax表達(dá)升高。提示甲氨蝶呤可能通過調(diào)控Bcl-2和Bax等凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞Caspase-3、9活化，促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡，抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖，減輕滑膜增厚而發(fā)揮治療作用。

總之，通過甲氨蝶呤對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型滑膜細(xì)胞凋亡基因調(diào)控體內(nèi)、體外的動物實驗研究，初證明了甲氨蝶呤對RA滑膜細(xì)胞有較強的誘導(dǎo)凋亡作用，為臨床上治療RA提供了實驗和理論依據(jù)，同時甲氨蝶呤在誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡有非常復(fù)雜的作用機(jī)制，涉及體液、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)中的多種調(diào)節(jié)因子、多種轉(zhuǎn)錄、代謝調(diào)控因素，故還需從其他相關(guān)基因或蛋白表達(dá)方面而做進(jìn)一步研究。

[1] Dhaouadi T, Sfar I, Abelmoula L,etal. Role of immune system,apoptosis and angiogenesis in pathogenesis of rheumatoid arthritis and joint destruction, a systematic review[J]. Tunis Med,2007,85(12): 991-998.

[2] Derk CT. Rheumatoid arthritis: an update[J]. Del Med J, 2015,77(2):59-63.

[3] Kawai S. Current drug therapy for rheumatoid arthritis[J]. J Orthop Sci,2013,8(2): 259-263.

[4] American college of rheumatology subcommittee on rheumatoid arthritis guidelines. Guidelines for the management of ruhematoid arthritis [J].Arthrisrheum, 2012,46(2):328-326.

[5] Rannou F,Francois M,Corvol MT. Cartilage breakdown in rheumatoid arthritis[J]. Joint Bone Spine,2006 ,73 (1) :29-36.

[6] 李 娟.艾拉莫德與甲氨蝶呤配伍治療老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎84例[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 45(1) : 120-121.

[7] 蔣 明,張奉春.風(fēng)濕病診斷與診斷評析[M]．上海:科學(xué)技術(shù)出版社,2004: 9-91.

[8] 繆 逸,朱建琴.來氟米特聯(lián)合甲氨喋吟治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎26例療效觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2012, 50(21 ) : 64-65．

[9] 王秀梅.來氟米特和白芍總苷聯(lián)合甲氨喋吟治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床觀察[J].中國醫(yī)藥科學(xué), 2011, 1 (2) : 69.

[10] 霍愛鑫.腫瘤壞死因子拮抗劑聯(lián)合甲氨蝶呤治療活動期中重度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎56例對比觀察[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 44(9) : 1209-1211.