林士森， 劉瑋潔， 林靖穎， 楊楠楠， 劉樹滔

(福州大學生物工程研究所， 福建 福州 350002)

0 引言

胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase， EC-SOD)是一類含Cu、 Zn原子的SOD酶類, 可高效催化超氧陰離子自由基歧化為H2O2與O2, 能夠清除體內多余的氧自由基[1]， 在組織損傷修復、 口腔癌、 肺損傷等方面的治療有明顯效果[2-4]， 具有較高潛在價值. 但EC-SOD在生物體內的含量遠低于其它SOD同工酶， 目前主要從動物主動脈和肺部中提取， 提取工藝繁瑣且最終獲取量較低， 不利于工業(yè)化生產應用[5-6]. 工業(yè)生產中為了解決產量少的問題， 通常利用基因工程技術構建高效表達菌株， 便于制備大量EC-SOD投入于生產應用. 但在許多表達系統(tǒng)中， 如細菌表達系統(tǒng)， 存在無法對真核蛋白進行正確的加工處理、 表達蛋白常以包涵體形式存在等一系列問題[7-8]； 在哺乳動物系統(tǒng)中， 其表達重組蛋白結構與天然蛋白高度相似但表達量較低[9]. 因此采用甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母表達體系， 表達的目的蛋白能夠分泌至胞外， 有利于工業(yè)上的分離純化， 其表達的蛋白能夠形成二硫鍵、 糖基化修飾等高級結構， 且表達量高， 與天然蛋白相似， 為人源EC-SOD的獲取提供了極大的便利[10].

目前已有構建EC-SOD表達菌株的少量報道， 在酵母表達系統(tǒng)的研究中[11]， 其發(fā)酵液通過超濾濃縮后， EC-SOD表達量也僅有0.45 mg·mL-1， 酶活力為760 U·mg-1， 可見其構建的表達菌株并不能滿足工業(yè)化需求， 并且N端存在多余氨基酸(谷氨酸、 苯丙氨酸)， 使重組蛋白與天然EC-SOD的N端結構存在一定差異. 本研究在前人基礎上， 致力于改善酶活較低， N端非天然產物等問題， 以人源EC-SOD基因為出發(fā)點， 對比畢赤酵母最適密碼子并對其修改， 以期顯著提高畢赤酵母的表達水平， 且與天然EC-SOD結構更加相似. 研究利用基因工程技術構建EC-SOD畢赤酵母表達菌株， 并對其表達的EC-SOD進行性質分析與酶活力測定.

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

pUC57由上海生工公司合成； 擴增菌株JM109、 表達菌株PichiapastorisX33及表達載體pPICZαA購自美國Invitrogen公司.

1.2 主要藥品與試劑

DNA marker DL5000、 DL2000， 限制性內切酶EcoR I、SacI、XhoI、SalI、 PCR mix等購自日本Takara公司； UNIQ-10柱離心式質粒小量抽提試劑盒、 瓊脂糖膠回收試劑盒、 Protein Molecular Weight Marker等購自上海生工生物工程公司、 美國Thermo Fish公司； 酵母提取物及胰蛋白胨等為美國Sigma公司產品； DEAE離子交換樹脂為日本TOSOH公司產品； 其余試劑藥品均為分析純.

1.3 實驗方法

1.3.1 表達載體的構建

由上海生工公司合成的含有人源EC-SOD密碼子優(yōu)化后基因(687 bp)的pUC57質粒， 質粒設計中在基因前后加入XhoⅠ(上游)和EcoRⅠ(下游)兩個酶切位點， 同時引入2個堿性氨基酸Lys 和Arg以實現(xiàn)目的蛋白的胞外分泌. 最終確定引物上游為CTCGAGAAAAGATGGACTGGTGA及下游引物為GAATTCTTAAGCAGCCTTACATTCAG.

將pPICZαA質粒用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切切開， 并從pUC57質粒上使用相同切下含有目的片段的序列(使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切后序列大于目的基因序列， 但由于在設計基因序列中尾端含有終止密碼子， 所以多余序列不影響表達)連接至pPICZαA載體上， 篩選重組質粒pPICZαA-EC-SOD， 轉E.coli.(JM109)， 篩選表達菌株JM109-EC-SOD提取質粒經EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切并PCR驗證篩選出目的菌株， 進一步使用SacⅠ線性化重組質粒進入畢赤酵母X33， 提取酵母基因組DNA經驗證篩出目的菌株.

1.3.2 畢赤酵母的誘導與表達

目的蛋白的實驗參考Invitrogen公司畢赤酵母表達手冊說明書. 重組菌株Pichia.(X33) 置于YPD 培養(yǎng)基中， 30 ℃搖培24 h后， 按1%的接種量轉接至不含葡萄糖的YP培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 待OD600= 3.0～5.0開始誘導(誘導前取樣)， 按1%(體積分數(shù))的誘導劑量添加甲醇， 每隔24 h補加甲醇至終體積分數(shù)為1%并取樣1 mL測酶活， 在誘導第6天和第7天后酶活趨于穩(wěn)定， 無明顯增加， 因此只需誘導5 d.

1.3.3 EC-SOD初步分離純化

由于目的蛋白理論等電點為6.4左右， 在pH值為8的條件下， 能使雜蛋白吸附到DEAE弱陰離子交換樹脂上， 目的蛋白不能被吸附， 從而起到分離的作用. 因此將發(fā)酵液離心后， 取上清3 L進行硫酸銨沉淀， 用30 mL pH值為8的緩沖液溶解沉淀， 并用截留相對分子質量為3 500 u隔夜透析. 使用柱體積30 cm×φ1 cm的層析柱， 以1 mL·min-1流速上樣5 mL樣品， 收集穿透峰并用OD280檢測及酶活測定， 驗證其中含有重組蛋白EC-SOD.

1.3.4 EC-SOD活性定性檢測

對發(fā)酵液12 000 r·min-1離心10 min， 收集上清， SDS-PAGE 觀察分析. 上清液與初步分離純化樣品采用鹽酸羥胺法測定SOD酶活力[12]， NBT活性電泳染色[13].

2 結果分析

2.1 表達載體的構建與驗證

以pPICZαA質粒為真核表達載體， 構建EC-SOD基因畢赤酵母表達質粒， 經EcoRⅠ，XhoⅠ雙酶切(見圖1)及PCR驗證(見圖2). 箭號處為目的基因， 且重組質粒經測序檢驗含有目的基因， 這些結果均表明目的片段已成功連接至表達載體上.

隨后將重組質粒使用SacⅠ線性化后， 電轉化至畢赤酵母X33中， 在Zeocin抗性平板挑取單菌落培養(yǎng)并提取酵母基因組DNA， 進行PCR驗證(見圖3).

圖1 重組質粒PCR產物Fig.1 PCR identification of the recombinant

圖2 重組質粒雙酶切Fig.2 Enzyme digestion identification of the recombinant

圖3 酵母基因組PCR驗證電泳圖Fig.3 PCR identification of the chromosome of Pichia pastoris

2.2 rcEC-SOD誘導與表達及活力鑒定

25 mL培養(yǎng)基在100 mL三角瓶中培養(yǎng)并誘導5 d， 收集每日菌液離心取上清， 進行SDS-PAGE分析(見圖4)， 并使用鹽酸羥胺法測定SOD酶活. 結果表明， 最終活力為178 U·mL-1， 比活為508 U·mg-1， 酶活隨誘導天數(shù)增加而升高(見圖5).

圖4為畢赤酵母X33重組菌株表達產物的SDS-PAGE電泳圖. 電泳結果顯示， 在相對分子質量為17與40 ku處， 誘導前未表達EC-SOD， 誘導后出現(xiàn)EC-SOD的蛋白條帶(見圖4上下箭頭部分)， 且蛋白質條帶伴隨著誘導時間的增加而逐漸加深.

圖4 畢赤酵母EC-SOD-X33發(fā)酵液上清電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of the supernatant from Pichia pastoris

圖5 畢赤酵母誘導過程中酶活變化趨勢圖Fig.5 Activity change trend of EC-SOD during the induction of Pichia pastoris for 5 days

2.3 rcEC-SOD初步分離純化

發(fā)酵液上清經過硫酸銨沉淀， 透析后使用DEAE弱陰離子交換樹脂進行初步分離純化， 在pH=8.0時上樣收集穿透峰， 用1 mol·L-1NaCl溶液洗脫雜蛋白. 純化結果如圖6所示， 箭頭處為穿透峰， 經酶活測定穿透峰中含有大量EC-SOD， 洗脫峰中未檢測到酶活性， 說明其中不含有EC-SOD. 收集穿透峰進行SDS-PAGE， 結果如圖7所示， 穿透樣品在17與40 ku處出現(xiàn)EC-SOD的蛋白條帶， 進一步證實EC-SOD富集在穿透峰.

圖6 EC-SOD-X33 DEAE弱陰離子交換樹脂初步分離Fig.6 Purification of EC-SOD in DEAE resin

圖7 EC-SOD-X33 DEAE弱陰離子交換樹脂初步分離Fig.7 Preliminary preparation with DEAE resin

2.4 rcEC-SOD活性電泳染色

為進一步驗證純化后蛋白活性， 進行氯化硝基四氮唑藍(NBT)法活性定性檢測. 取發(fā)酵液上清與過DEAE弱陰離子樹脂初步分離純化液進行Native-Page凝膠電泳后， 利用NBT法對PAGE膠進行活性定性檢測. 結果如圖8、 9所示， 在沒有EC-SOD的位置為藍紫色背景， 發(fā)白位置出現(xiàn)清晰透明的SOD活性染色條帶， 證實純化的蛋白具有SOD酶活性.

圖8 發(fā)酵上清液NBT活性染色Fig.8 Supernatant in native-page and stain with NBT

圖9 初步分離純化蛋白活性染色Fig.9 Preliminary preparation in native-page and stain with NBT

3 討論

實驗在畢赤酵母表達系統(tǒng)中， 成功構建重組pPICZαA質粒， 并在Pichiapastoris中成功胞外分泌表達， 分泌出的EC-SOD蛋白具有活性高、 易分離純化、 與天然蛋白相似的特點.

在畢赤酵母構建EC-SOD表達菌株的相關研究中， 已經有學者做過相關實驗[11]， 將發(fā)酵液濃縮后進行性質分析， 濃縮后比活約為760 U·mg-1， 該實驗采用ELISA法定量出EC-SOD的蛋白含量， 所以比活相當于純化后的蛋白比活. 但該研究未對EC-SOD基因進行密碼子優(yōu)化， N端存在多余的氨基酸(谷氨酸、 苯丙氨酸)， 因此表達量與結構特性等方面有待提高.

本研究在前人研究的基礎上加以改進， 首先對天然EC-SOD的基因序列進行密碼子優(yōu)化， 從理論上能夠提高酵母的表達水平， 并刪去N端信號肽， 直接連接畢赤酵母中的KEX2水解酶. 其次在序列設計中， 實驗設計的蛋白序列與天然的EC-SOD一致， 擁有極其相似的生理活性. 經酶活與蛋白量測定， 在25 mL搖瓶上清液的比活約為508 U·mg-1， EC-SOD蛋白表達量為0.19 mg·mL-1， 5 L發(fā)酵罐中比活約909 U·mg-1， 經DEAE初步純化后， 比活約為1 700 U·mg-1. 因此， 本實驗中發(fā)酵上清液(未濃縮)的蛋白表達量和酶活都與前人實驗中濃縮后的結果相近， 甚至更好. 由于實驗設計的EC-SOD的N端序列與天然一致， 因此在比活力上得到顯著提升. 通過NBT染色實驗， 進一步驗證重組菌株表達出具有活性的EC-SOD蛋白.

在實驗的最終發(fā)酵產物中， 發(fā)現(xiàn)可能視為單體(17 ku)與二聚體(40 ku)的重組蛋白同時存在， 也可能是雜蛋白形式存在， 但并未對其作出驗證， 需通過后續(xù)實驗進一步分析. 通過文獻查閱得知， 天然的EC-SOD主要是以四亞基形式存在， 亞基之間是靠疏水作用結合[14-15]， 因此在SDS-PAGE僅能打斷分子間的二硫鍵. 相關研究也表明重組表達的EC-SOD具有單體與二聚體結構共存的現(xiàn)象， 并且在Cu/Zn SOD中也存在類似單體與二聚體共存的情況[16]， 由此可推斷EC-SOD在溶液中可能存在多聚體結構.

參考文獻：

[1] TIBELL L, AASA R, MARKLUND S L. Spectral and physical properties of human extracellular superoxide dismutase a comparison with CuZn superoxide dismutase[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1993, 304(2): 429-433.

[2] LAURILA J P, CASTELLONE M D, CURCIO A,etal. Extracellular superoxide dismutase is a growth regulatory mediator of tissue injury recovery[J]. Molecular Therapy the Journal of the American Society of Gene Therapy, 2009, 17(3): 448-454.

[3] YEN C C, LAI Y W, CHEN H L,etal. Aerosolized human extracellular dismutase prevents hyperoxia-induced lung injury[J]. PloS One, 2011, 6(10): e26870.

[4] 張超賢， 郭李柯， 郭曉鳳. EC-SOD和GSTM1 基因多態(tài)性及吸煙與口腔癌風險關系研究[J]. 衛(wèi)生研究, 2012, 41(4): 555-561.

[5] PETERSEN S V, OURY T D, OSTERGAARD L,etal. Extracellular superoxide dismutase (EC-SOD) binds to type I collagen and protects against oxidative fragmentation[J]. The Journal of Biological Chemistry. 2004, 279(14): 13705-13710.

[6] FATTMAN C L, ENGHILD J J, CRAPO J D,etal. Purification and characterization of extracellular superoxide dismutase in mouse lung[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2000, 275(2): 542-548.

[7] SON Y J, BAE J Y, CHONG S H,etal. Expression, high cell density culture and purification of recombinant EC-SOD inEscherichiacoli[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 162(6): 1585-1598.

[8] 朱希強, 袁勤生. 重組人EC-SOD包涵體的稀釋復性及重折疊后蛋白的純化[J]. 中國生物制品學雜志, 2005, 18(3): 252-255.

[9] KIM S, KIM H Y, KIM J H,etal. Enhancement of potency and stability of human extracellular superoxide dismutase[J]. BMB Rep, 2015, 48(2): 91-96.

[10] CEREGHION G P L, CEREGHINO J L, LLGEN C,etal. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of yeastPichiapastoris[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13(4): 329-332.

[11] CHEN H L, YEN C C, TSAI T C,etal. Production and characterization of human extracellular superoxide dismutase in the methylotrophic yeastPichiapastoris[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(21): 8041-8047.

[12] ZHANG C, BRUINS M E, YANG Z Q,etal. A new formula to calculate activity of superoxide dismutase in indirect assays[J]. Analytical Biochemistry, 2016, 503: 65-67.

[13] 羅廣華, 王愛國. 植物SOD的凝膠電泳及活性的顯示[J]. 植物生理學通訊, 1983(6): 44-45.

[14] PETERSEN S V, OURY T D, VALNICKOVA Z,etal. The dual nature of human extracellular superoxide dismutase: one sequence and two structures[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100(24): 13875-13880.

[15] OURY T D, CRAPO J D, VALNICKOVA Z,etal. Human extracellular superoxide dismutase is a tetramer composed of two disulphide-linked dimers: a simplified, high-yield purification of extracellular superoxide dismutase[J]. Biochemical Journal, 1996, 317(Pt 1): 51-57.

[16] 楊志強, 張晨, 敖偉, 等. 畢赤酵母表達重組人源Cu/Zn SOD的分離純化與穩(wěn)定性表征[J]. 中國食品學報, 2011, 11(5): 108-113.