李夢琪， 傅 紅, 2， 張翠平， 歐陽全興， 王 琳， 葉秀云, 2

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350116； 2. 福建省海洋酶工程重點實驗室， 福建 福州 350116)

0 引言

離子液體是指在室溫環(huán)境下呈現(xiàn)液態(tài)的、 完全由陰陽離子組成的低溫熔融鹽， 一般由有機陽離子和無機陰離子構(gòu)成. 與傳統(tǒng)有機溶劑相比， 離子液體具有熱穩(wěn)定性高、 蒸汽壓低和對環(huán)境友好等特點， 被稱為“綠色”溶劑. 近年來離子液體作為各類酶反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)備受關(guān)注[1-3]. 自Rantwijk等[4-5]在一些酶催化的酯化反應(yīng)中運用離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機溶劑以來， 許多研究表明離子液體作為脂肪酶催化反應(yīng)的媒介， 可能影響酶分子周圍的微水相環(huán)境， 并改變酶與底物的接觸面積以及與底物間的相互影響， 從而提高脂肪酶的穩(wěn)定性和增強酶活力.

天然形式的深海魚油是甘油三酯型， 其EPA(eicosapentaenoic acid)和DHA(docosahexaenoic acid)的總含量一般在18%～30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 以下均同)左右. 通過甲乙酯化反應(yīng)及分子蒸餾技術(shù)可將產(chǎn)物甲乙酯型魚油的EPA和DHA總含量提高至70%左右. 但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明， 從人體吸收率和對甲乙醇敏感的人群而言， 甘油三酯魚油在食用安全性上比甲乙酯型魚油更具優(yōu)勢[6]， 因此提高甘油三酯型魚油中ω-3多不飽和脂肪酸含量的技術(shù)已成為研究熱點. 目前大量學(xué)者采用在無溶劑體系或有機溶劑體系下的脂肪酶催化酯交換反應(yīng)來提高甘油三酯中EPA和DHA的質(zhì)量百分含量， 總含量大多在50%左右[7-9]. 李金章等[10]從多種脂肪酶中篩選了TLIM作為催化劑， 催化魚油甘油酯與乙酯發(fā)生酯交換反應(yīng)， 得到了EPA和DHA總含量為45.6%的甘油酯魚油. 宋詩軍等[11]在無溶劑體系下利用Novozyme435催化濃縮魚油乙酯與ω-3脂肪酸含量為43%的混合甘油酯進(jìn)行酯交換反應(yīng)， 產(chǎn)物甘油酯中的EPA和DHA含量分別可達(dá)40.4%和28.6%. 但是到目前為止， 還沒有對離子液體應(yīng)用在脂肪酶催化的魚油酯交換反應(yīng)中的效果有明確的研究報道. 因此， 本研究以3種易于合成且性質(zhì)穩(wěn)定的二烷咪唑類離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM][BF4])、 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(BMIM][PF6])和1-丁基-3甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽([BMIM][Tf2N])分別作為魚油酯交換反應(yīng)的介質(zhì)[12]， 研究3種離子液體對脂肪酶催化活力和脂肪酶催化魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物ω-3脂肪酸的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與原料

甘油三酯型魚油(EPA： 19.21%； DHA： 10.81%)、 乙酯型魚油(EPA： 42.47%； DHA： 31.91%)由福建高龍海洋生物工程有限公司惠贈； Novozyme435酶、 TLIM酶， 購自丹麥諾維信公司； 豬胰脂酶購自上海三杰生物技術(shù)有限公司； 離子液體[BMIM][BF4]、 [BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]， 購自上海成捷化學(xué)有限公司， 其主要物理性質(zhì)如表1所示； 其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純.

表1 3種離子液體的主要物理性質(zhì)

1.2 實驗方法

1.2.1 魚油理化性質(zhì)測定

水分及揮發(fā)物的測定參考《動植物油脂水分及揮發(fā)物含量測定(GB/T 5528—2008)》[13]； 酸值的測定參考《動植物油脂酸值和酸度測定(GB/T 5530—2005)》[14]； 皂化值的測定參考《動植物油脂皂化值的測定(GB/T 5534—2008)》[15]； 碘值的測定參考《動植物油脂碘值的測定(GB/T 5532—2008)》[16]； 過氧化值的測定參考《動植物油脂過氧化值測定(GB/T 5538—2005)》[17].

1.2.2 離子液體中酶活的測定方法

參考國家標(biāo)準(zhǔn)《脂肪酶制劑(GB/T 23535—2009)》[18]， 用恒電位自動滴定法測定脂肪酶在離子液體中催化橄欖油的水解活性. 將40 mL磷酸鹽緩沖液和2 mL橄欖油的混合溶液(空白對照樣品)， 或40 mL磷酸鹽緩沖液和2 mL橄欖油的混合溶液及定量的離子液體加入到100 mL燒杯中(TLIM酶不加磷酸緩沖液)， 放入30 ℃恒溫水浴中預(yù)熱30 min. 預(yù)熱完成后， 用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0后， 加入準(zhǔn)備好的酶液2 mL， 用0.1 mol·L-1NaOH開始滴定， pH值恒定不變， 記錄15 min內(nèi)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(V，mL)， 以同樣方法滴定空白溶液， 消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積作為空白值(V0，mL). 測定條件下每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶活性為1個酶活力單位. 酶活力 (μmol·min-1) 按照式(1)計算， 相對酶活力(%)按照式(2)計算[19].

(1)

(2)

1.2.3 酯交換反應(yīng)及產(chǎn)物分離

將5 g乙酯型魚油與5 g甘油三酯型魚油攪拌混勻， 混勻的底物裝入已經(jīng)設(shè)置為52 ℃的超級恒溫水浴鍋中的雙層燒杯中， 加入底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%(0.3 g)的脂肪酶及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、 2%、 4%、 6%、 8%和10%)的離子液體， 密封避光， 待反應(yīng)24 h后終止反應(yīng). 過濾反應(yīng)產(chǎn)物， 除去脂肪酶固體， 離心分層， 上層液體即為混合魚油. 將產(chǎn)物點樣至層析板上進(jìn)行層析[7]， 顯色后刮下甘油三酯部分的層析硅膠， 待甲酯化反應(yīng)使用.

1.2.4 甲酯化及氣相色譜分析

取經(jīng)硅膠層析分離出的魚油樣品(甘油三酯)， 裝在50 mL容量瓶中， 加入10 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鈉-甲醇溶液， 在65 ℃的恒溫水浴中皂化20 min使油珠完全溶解， 然后冷卻； 再加入甲醇-三氟化硼乙醚溶液(三氟化硼-乙醚溶液與無水甲醇以1∶3(體積比)配制而成， 現(xiàn)配現(xiàn)用)， 將混合物在70 ℃恒溫水浴中沸騰20 min； 取出冷卻后， 加入10 mL正己烷， 并充分振蕩[20]， 使脂肪酸甲酯溶于正己烷溶劑中； 再加入飽和NaCl溶液， 至距離容量瓶口大約2 cm處， 此時， 容量瓶上層液體即為正己烷， 用注射器抽出上層溶液， 放入試管中， 用氮吹儀將溶劑除去， 收集甲酯化樣品供分析之用.

采用GC7890氣相色譜儀， Agilent 112-88A7 HP-88毛細(xì)管色譜柱， 其規(guī)格為100 m×250 μm×0.20 μm. 檢測器為火焰離子化檢測器(FID)， 載氣為純氮氣， 其流速為1.0 mL·min-1， 氫氣流速為35.0 mL·min-1， 空氣流速為350 mL·min-1. 進(jìn)樣口溫度設(shè)為250 ℃， 檢測器溫度設(shè)為280 ℃. 程序升溫： 柱溫140 ℃保持5 min， 以4 ℃·min-1程序升溫至220 ℃， 持續(xù)保持35 min； 尾吹氣為氮氣， 流速45 mL·min-1； 進(jìn)樣量1 μL， 進(jìn)樣方式： 分流， 分流比20∶1(體積比)[21].

平行試驗3次.

2 結(jié)果與討論

2.1 原料魚油理化性質(zhì)

脂肪酶酶解反應(yīng)的底物甘油三酯型魚油及乙酯型魚油， 其理化性質(zhì)指標(biāo)如表2所示. 研究所選用的作為反應(yīng)底物的原料魚油各項理化性質(zhì)指標(biāo)都符合國家對魚油食用標(biāo)準(zhǔn)的一級標(biāo)準(zhǔn)[22].

表2 反應(yīng)底物甘油三酯及乙酯型魚油的理化性質(zhì)

2.2 離子液體對脂肪酶活力的影響

特異性脂肪酶TLIM、 豬胰酯酶和非特異性脂肪酶Novozyme435是在魚油酯交換反應(yīng)中最常用且效果較好的3種脂肪酶[7, 23]. 分別在親水性離子液體[BMIM][BF4]、 兩種疏水性離子液體[BMIM][PF6]及[BMIM][Tf2N]中對上述脂肪酶的催化活性進(jìn)行測定， 相對不加離子液體的酶活力結(jié)果如圖1所示.

由圖1可知， 與不含離子液體的磷酸鹽反應(yīng)體系相比， 3種脂肪酶在不同離子液體介質(zhì)中的酶活力均顯著增加. 其中， 在親水性離子液體[BMIM][BF4]中達(dá)到最大相對酶活， TLIM、 豬胰脂酶及Novozyme435對應(yīng)的[BMIM][BF4]最適質(zhì)量濃度均為45 g·L-1左右， 最大相對酶活力分別為1 030%， 1 090%和687%. 此外， 結(jié)果還表明3種脂肪酶在兩種疏水性離子液體[BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]中的酶活變化趨勢大致相同， 達(dá)到最大相對酶活力時的離子液體質(zhì)量濃度均為30 g·L-1左右. 相關(guān)研究[4, 19]表明這3種離子液體可大幅度提高脂肪酶活力， 可能是由于離子液體對油水混合體系的乳化效果更好， 離子液體的加入可有效增大底物的溶解度從而增大底物和酶接觸機會[24]， 為脂肪酶的催化反應(yīng)提供一個更加緊湊適宜的微環(huán)境[25].

圖1 3種離子液體對脂肪酶活力的影響Fig.1 Effect of the three ionic liquids on lipase activity

由圖1還可知， 脂肪酶在離子液體中的相對酶活力隨離子液體濃度的增加均呈先增后減的趨勢， 這可能是由于隨著離子液體添加量的增加， 反應(yīng)底物濃度及反應(yīng)速率降低了， 不利于反應(yīng)的正向進(jìn)行； 同時， 與有機溶劑及甘油三酯相比， 離子液體的黏度較大， 導(dǎo)致反應(yīng)體系的黏度隨離子液體添加量的增大而增大， 當(dāng)黏度增大到一定程度， 反應(yīng)體系的傳質(zhì)阻力增大[1, 26]， 阻礙底物與酶分子的相互作用， 不利于反應(yīng)進(jìn)行.

2.3 離子液體對脂肪酶催化魚油酯交換反應(yīng)的影響

圖1的結(jié)果表明離子液體可大幅提高脂肪酶活力， 因此將3種離子液體應(yīng)用在以甘油三酯型魚油和乙酯型魚油為底物的魚油酯交換反應(yīng)中， 其中甘油三酯型魚油的ω-3脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.02%， 乙酯型魚油的ω-3脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.38%. 考察離子液體添加量對產(chǎn)物甘油三酯魚油中EPA和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響， 結(jié)果如圖2所示.

圖2 3種離子液體添加量對魚油酯交換反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of the three ionic liquids additive amount on transesterification of fish oil

由圖2可知， 離子液體使魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯EPA和DHA的平均得率提高了20%以上. 其中， 當(dāng)使用特異性脂肪酶TLIM和豬胰脂酶， 并以疏水性離子液體[BMIM][Tf2N]或[BMIM][PF6]作為反應(yīng)介質(zhì)時， 產(chǎn)物甘油三酯魚油中ω-3脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高. 當(dāng)[BMIM][Tf2N]添加量為4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 以下同)時， TLIM催化魚油酯交換產(chǎn)物甘油三酯的EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了63.65%， 較不加離子液體的空白對照樣提高了11.79 %.

對于魚油酯交換反應(yīng)而言， 上述實驗結(jié)果有兩個顯著特征， 一是具有位置特異性的脂肪酶TLIM和豬胰脂酶反應(yīng)效果優(yōu)于非特異性脂肪酶Novozyme435； 二是疏水性離子液體效果優(yōu)于親水性離子液體. 究其原因， 可能和反應(yīng)體系特征密切相關(guān). 研究表明， EPA和DHA等多不飽和脂肪酸大部分連接在甘油三酯的2位[27]， 而Sn-1, 3特異性脂肪酶選擇性水解魚油時， 可以更多地作用于甘油酯1和3位置上的脂肪酸進(jìn)行酯交換反應(yīng)， 從而最大程度地使甘油酯2位置上的脂肪酸保留下來， 最終提高反應(yīng)產(chǎn)物中ω-3脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù). 另一方面， 雖然由前述離子液體對脂肪酶活力的影響效果來說， 3種脂肪酶在親水性離子液體[BMIM][BF4]中酶活較高， 但是其對應(yīng)的酶活測定體系是含有磷酸緩沖液的含水體系， 酶活指標(biāo)反映的主要是脂肪酸的水解得率， 因此和無水溶劑的酯交換反應(yīng)有所不同. 由于魚油酯交換反應(yīng)在非水溶劑體系下進(jìn)行， 而疏水性離子液體在非水相體系下， 可最大程度地增加底物與酶的接觸機會， 使得酶外圍的水分子層的介電常數(shù)比離子液體更高， 導(dǎo)致酶與水分子結(jié)合牢固， 空間形態(tài)結(jié)構(gòu)不易改變， 因此酶的催化活性能夠得以維持， 有利反應(yīng)進(jìn)行. 另外PF6-、 Tf2N-的負(fù)電荷比較分散， 形成氫鍵的能力較弱， 對酶的分子結(jié)構(gòu)影響較小[4]. 這可能是在非水環(huán)境下魚油酶法酯交換反應(yīng)中疏水性離子液體效果要好于親水性離子液體的主要原因.

2.4 產(chǎn)物脂肪酸成分分析

為了考察離子液體對魚油酶法酯交換產(chǎn)物脂肪酸的影響效果， 研究以TLIM脂肪酶為例， 分別對不添加離子液體及[BMIM][Tf2N]為最佳添加量(4%)時， 酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯的脂肪酸成分及脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行對比分析， 結(jié)果如表3所示.

表3 離子液體[BMIM][Tf2N]為介質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯脂肪酸組成及含量

注： TG代表甘油三酯； EE代表乙酯

由此可見， 離子液體體系下產(chǎn)物甘油三酯型魚油的EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.31%， DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.34%， 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了63.65%， 遠(yuǎn)高于底物甘油三酯型魚油的EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)30.02%， 同時也顯著高于非離子液體體系下的脂肪酶TLIM催化反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)51.86 %. 因此， 以離子液體為介質(zhì)可以提高脂肪酶催化魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯中EPA和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù). 酯交換反應(yīng)主要是甘油三酯型底物魚油中的C14∶0、 C16∶0、 C16∶1和C18∶1與乙酯型底物魚油中的EPA和DHA進(jìn)行了交換， 從而提高了產(chǎn)物甘油三酯魚油中EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

3 結(jié)語

離子液體作為一種新型“綠色”溶劑， 已替代傳統(tǒng)有機溶劑作為各種酶促反應(yīng)的介質(zhì). 研究表明TLIM、 Novozyme435及豬胰脂酶3種脂肪酶在離子液體[BMIM][BF4]、 [BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]中的酶活均有提升. 其中， 當(dāng)[BMIM][BF4]質(zhì)量濃度為45 g·L-1時， 豬胰脂酶的相對酶活力達(dá)到1 090%. 將離子液體加入魚油酯交換反應(yīng)中作為反應(yīng)介質(zhì)后， 魚油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物甘油三酯EPA和DHA的平均得率提高了20%以上， 且疏水性離子液體效果好于親水性離子液體. 當(dāng)[BMIM][Tf2N]添加量為4%時， TLIM催化魚油酯交換產(chǎn)物甘油三酯的EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了63.65%， 較不加離子液體提高了11.79%.

參考文獻(xiàn)：

[1] 李晶, 王俊, 張磊霞, 等. 離子液體中脂肪酶催化酯類合成的新進(jìn)展[J]. 有機化學(xué), 2012, 32(7): 1186-1194.

[2] GUO Z, DERYA K, XU X. Improving enzymatic production of diglycerides by engineering binary ionic liquid medium system [J]. New Biotechnology, 2009, 26(1): 37-43.

[3] LIANG J, ZENG W, YAO P,etal. Lipase-catalyzed regioselective synthesis of palmitolyglucose ester in ionic liquids[J]. Advances in Biological Chemistry, 2012, 2(3): 226-232.

[4] RANTWIJK F V, LAU R M, SHELDON R A. Biocatalytic transformatiom in ionic liquids[J]. Trends in Biotechnology, 2003, 21(3): 131-138.

[5] VIDYA P, ANJU C. The role of different anions in ionic liquids onPseudomonascepacialipase catalyzed transesterification and hydrolysis[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 57(22): 145-148.

[6] 陳殊賢, 鄭曉輝. 微藻油和魚油中DHA的特性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(21): 439-444.

[7] 郭正霞, 孫兆敏, 張芹, 等. 酶法催化乙酯甘油酯酯交換制備富含EPA和DHA的甘油酯[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(20): 176-180.

[8] LINDER M, KOCHANOWSKI N, FANNI J,etal. Responsesurace optimization of lipase-catalysed esterification of glycerol andn-3 polyunsaturated fatty acids from salmon oil[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(1): 273-279．

[9] 楊博, 楊繼國, 呂揚效, 等. 脂肪酶催化魚油醇解富集EPA和DHA的研究[J]. 中國油脂, 2005, 30(8): 64-67.

[10] 李金章, 王玉明, 薛長湖, 等. 脂肪酶催化乙酯甘油酯酯交換制備富含EPA和DHA的甘油三酯[J]. 油脂化學(xué), 2011, 36(1): 13-16.

[11] 宋詩軍, 夏松養(yǎng), 林曉坪, 等. 酶法制備高含量EPA、 DHA甘油酯[J]. 農(nóng)業(yè)機械, 2013(11): 47-51.

[12] 杜海楓. 離子液體中脂肪酶催化酯化、 轉(zhuǎn)酯反應(yīng)[D]. 長春： 東北師范大學(xué), 2006: 6-10.

[13] 中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)督局. 動植物油脂水分及揮發(fā)物含量測定： GB/T 5528—2008[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[14] 中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)督局. 動植物油脂酸值和酸度測定： GB/T 5530—2005[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2005.

[15] 中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)督局. 動植物油脂皂化值的測定： GB/T 5534—2008[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[16] 中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)督局. 動植物油脂碘值的測定： GB/T 5532—2008[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[17] 中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)督局. 動植物油脂過氧化值測定： GB/T 5538—2005[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2005.

[18] 中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)督局. 脂肪酶制劑： GB/T 23535—2009[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

[19] 趙煒, 黃卓楠, 李娜. 恒電位自動滴定法分析脂肪酶水解活性影響因素[J]. 分析化學(xué), 2011, 39(3): 351-355.

[20] 劉復(fù)光. 油脂專業(yè)分析[Z]. 無錫: 無錫輕工大學(xué)食品學(xué)院, 1997: 37-38.

[21] 孫兆敏. 酶法制備n-3多不飽和脂肪酸甘油三酯的工藝[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2010: 14-15.

[22] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 魚油： SC/T 3502—2016[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2016.

[23] 孫麗萍. 脂肪酶水解魚油富集DHA和EPA甘油酯的研究[D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué), 2006: 11-12.

[24] MAGNUSON D K, BODLEY J W, EVANS D F. The activity and stability of alkaline phosphatase in solutions of water and the fused salt ethylammonium nitrate[J]. Food of Solution Chemistry, 1984, 13(8): 583-587.

[25] SUN S, QIN F, BI Y,etal. Enhanced transesterification of ethyl ferulate with glycerol for preparing glyceryl diferulate using a lipase in ionic liquids as reaction medium[J]. Biotechnol Lett, 2013, 35(9): 1449-1454.

[26] SHI Y, WU Y, LU X,etal. Lipase-catalyzed esterification of ferulic acid with lauryl alcohol in ionic liquids and antibacterialpropertiesinvitroagainst three food-related bacteria[J]. Food Chemistry, 2016, 220(3): 249-256.

[27] 唐青濤, 余若黔, 宗敏華, 等. 脂肪酶富集DHA和EPA的研究進(jìn)展[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2001, 16(4): 289-292.