王麗萍,李 丹,許銳偉,吳雪茜 (中國礦業(yè)大學環(huán)境與測繪學院,江蘇 徐州 221116)

在石油開采、運輸、儲藏、加工、利用過程中,不合理的作業(yè)方式或意外事故導(dǎo)致大量石油進入土壤環(huán)境,發(fā)生一系列物理、化學、生化反應(yīng),造成嚴重的土壤石油污染.生物修復(fù)技術(shù)由于其環(huán)境友好性、經(jīng)濟性等優(yōu)勢已經(jīng)逐漸成為當代修復(fù)石油污染土壤的重要手段之一,具有較大潛力[1-2].

已有研究表明, 單一菌種通常只能降解特定組份的單一石油烴,多組分的石油烴降解需要多種微生物參與,保證反應(yīng)的逐步進行.由于石油烴的復(fù)雜性,專性菌系誘導(dǎo)生物降解比單一菌更有效,它能夠適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境條件,可以實現(xiàn)石油烴的高效降解[3-4].具有高活性、持久性和兼容性專性菌的選育一直是研究重點.

影響專性菌系降解石油烴效果的環(huán)境因素有營養(yǎng)元素,溫度,pH 值,石油烴的難溶性和土壤的強吸附作用等[5].十二烷基硫酸鈉(SDS),直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS),脂肪醇聚氧乙烯醚(Brij 30),聚山梨酯-80(吐溫 80)和生物表面活性劑對生物降解石油烴的影響表明,以上表面活性劑均能顯著提高石油烴的溶解度,大大增強其在土壤中的生物可得性[6-7].近來有學者采用微生物-表面活性劑復(fù)合技術(shù)來修復(fù)污染土壤并取得了良好的效果,但不同類型表面活性劑對專性菌系降解石油烴的影響機制需要進行進一步研究探索.因此,選擇合適的表面活性劑來增強專性菌系對石油烴的降解效果是有必要的.

本研究將生物強化與表面活性劑結(jié)合起來,采用液相“中間產(chǎn)物-目標污染物”專性降解菌的雙底物馴化方式得到穩(wěn)定、健全的具有高效降解能力的專性菌系,并篩選適合模擬石油污染土壤的表面活性劑,以達到提高污染土壤中石油烴降解率的目的.隨后進行土壤修復(fù)實驗,進一步評估最佳環(huán)境條件下專性菌系對石油污染土壤修復(fù)性能,從而為實際土壤修復(fù)提供可靠的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 石油烴由徐州市中國石化集團管道儲運公司提供.活性污泥采自徐州華裕煤氣有限公司焦化廢水處理廠的污泥濃縮池.本研究中使用的未受污染的頂層土壤取自中國礦業(yè)大學校園東南角(117°9′10″E,34°13′4″N)的砂土.從土壤表面10～20cm處取樣,將采集的土樣密封在聚乙烯袋中.風干 5d,將大塊土壤破碎研磨并用60目篩篩分以除去大顆粒和碎屑.將50g石油烴溶于5mL甲醇,并加入到1kg土壤中,然后再次風化攪拌均勻.將土壤儲存在玻璃罐中老化 50d.總石油烴(TPH)的濃度和配置土壤的物理化學性質(zhì)如表1所示.

表1 配置土壤的物理化學性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of composite soil

1.1.2 無機鹽營養(yǎng)液 無機營養(yǎng)液為污泥馴化時所用,每升活性污泥中添加 2.0g NH4Cl、2.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、1.0g MgSO4·7H2O;120mg FeCl3、50mg H3BO3、10mg CuSO4·5H2O、10mg KI、45mg MnSO4·H2O、20mg NaMoO4·2H2O、75mg ZnCl2·4H2O 、 50mg CoCl2·6H2O、 20mg AlK(SO4)2·12H2O 、 13mg CaC12·2H2O 、 10mg NaCl.

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種馴化與鑒定 專性菌系的馴化采用液相“中間產(chǎn)物-目標污染物”專性降解菌的雙底物馴化方式[8].用生理鹽水稀釋高溫滅菌后的活性污泥配置懸浮液,為了去除活性污泥中的營養(yǎng)元素,需要在塑料桶中曝氣 48h.然后進入液相馴化階段,每日加入一定量無機營養(yǎng)液,并在濃度50～2000mg/L范圍內(nèi)用梯度遞增的方法投加底物.馴化方案如圖1所示.30d后,菌液密度穩(wěn)定在1.2g/L左右,表明馴化過程結(jié)束.取馴化第30d菌懸液中的菌群作為試驗用菌群.

針對馴化前和馴化后樣品,分別取細菌培養(yǎng)液5mL,采用TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)進行DNA快速提取.通過紫外分光亮度計測定 DNA濃度和純度(OD260/OD280和OD260/OD230).利用洗脫緩沖液TE將DNA進行10倍梯度稀釋后,進行PCR擴增.樣品保存于-20℃冰箱中待用.

圖1 石油烴專性菌系的馴化實驗方案Fig.1 Domestication schedule of petroleum hydrocarbon specific bacteria

DNA保存菌株的 16SrDNA序列分析參考文獻[9]進行.對16SrDNA的雙V區(qū)(V3-V4)進行PCR擴增,采用細胞引物 338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)及806R(5-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3),測序 V3V4區(qū).高通量測序工作由派森諾生物公司完成,所用測序平臺為Illumina Miseq.相關(guān)序列已提交給GenBank,序列號為SRP083938.

1.2.2 石油烴的測定 純水和水土體系中的石油烴含量用紅外分光光度法測定,操作步驟參考HJ 637-2012[10].樣品中石油烴的濃度 C(mg/L)與石油烴降解率(%)的計算方法見式(1)～式(2).

式中:C為樣品中石油烴的濃度,mg/L;X、Y、Z、F為校正系數(shù);A2930, A2960, A3030為各對應(yīng)波數(shù)下測得的萃取液吸光度;V0為萃取液溶劑的體積,mL;VW為樣品體積,mL;D為萃取液稀釋倍數(shù);C0為污染土壤中石油烴初始濃度,mg/L; Ct為t時刻石油烴濃度,mg/L.

1.2.3 最適溫度和pH值的確定 在250mL錐形瓶中加入 100mL無機鹽培養(yǎng)基,并加入 9mL菌液使保持菌液密度在 0.1g/L,并加入 10g人工配置的污染土.(1)調(diào)節(jié)pH值為中性,溫度分別設(shè)置為 10,20,30,35,40℃;(2)溫度設(shè)置為 30℃,用稀HCl與0.6%的NaOH溶液將pH值 分別調(diào)節(jié)為5,6,7,8,9;轉(zhuǎn)速 180r/min,置于搖床振蕩培養(yǎng)6,12,18,24,48,72h后,分別測定石油烴降解率.每組設(shè)立 3個平行樣,每天補充試驗過程中蒸發(fā)的去離子水.

1.2.4 臨界膠束濃度(CMC)的測定 室溫(25℃)條件下,水土比為10:1時,采用JYW-200A全自動液體界面張力測試儀測定不同濃度吐溫 80及SDS的表面張力,繪制表面張力與表面活性劑濃度對數(shù)的關(guān)系曲線,根據(jù)圖中的拐點,計算出CMC值:吐溫80的CMC為75mg/L, SDS的CMC為2500mg/L.

1.2.5 吐溫80和 SDS對專性菌系降解石油烴的影響 將10g滅菌的土壤加入100mL去離子水中,加入9mL菌液保持菌液密度在0.1g/L左右.接種后分別加入 0.25,0.5,1,2和 5CMC吐溫 80和 SDS.然后將溶液置于搖床中振蕩培養(yǎng)(25℃,180rpm)72h.使用傅里葉變換紅外(FTIR)光譜儀(Thermo iS5,Nicolet Instrument Corporation,USA)進行水土體系中的石油烴濃度分析.

1.2.6 表面活性劑-專性菌系體系修復(fù)石油污染土壤模擬試驗 本課題組前期研究確定,最適合本修復(fù)試驗的條件為 C:N:P=100:4:0.67.在木質(zhì)容器中進行石油烴污染土壤修復(fù)試驗,設(shè)置 3個試驗組:未接種專性菌系、未投加吐溫80(對照組 S0),接種專性菌系同時投加吐溫 80(S1),只接種降解菌、未投加吐溫 80(S2).每個試驗組加入1kg石油烴污染土壤,石油烴初始濃度為 5%(w/w),菌液接種量為 10%(v/w).試驗在室溫下進行,pH值為7～8.每5d加一次營養(yǎng)液.定時補充水分,使其含水量保證在 30%～40%,每周翻轉(zhuǎn)一次土壤以確保整個試驗過程中氧含量充足.通過FTIR光譜儀定期測定石油烴濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 石油烴高效專性菌系的馴化與鑒定

將焦化廢水處理廠的活性污泥作為菌源,利用高通量測序技術(shù)鑒定菌群結(jié)構(gòu).共發(fā)現(xiàn)了 278個OTU(操作分類單元),顯示出菌落的生物多樣性.如表2所示,Alphaproteobacteria和gammaproteobacteria占主導(dǎo)地位,其含量分別為 32%和 46%.這與前人的研究相符, Alphaproteobacteria和gammaproteobacteria通常廣泛存在于長期被石油烴污染的環(huán)境中[11].進一步分析這兩類菌的屬種水平,其中,Rhodanobacter sp.是優(yōu)勢菌種,占比 34%.Al-Jawasim等研究證實,Rhodanobacter是石油烴污染土壤中的主要菌種.此外,土壤中檢測出大量的Mycobacterium sp.和 Rhizobium sp.,分別占比12%和 11%.兩種菌都能夠?qū)⑹蜔N作為碳源[12-13].單一優(yōu)勢降解菌降解單組分有機污染物取得較好的效果,通常被引入到反應(yīng)器中強化生態(tài)系統(tǒng)的凈化性能和穩(wěn)定性[14].但土壤中的有機污染物通常存在多組分共存時的相互抑制致使單一優(yōu)勢菌種難以同時將其去除的問題.另一方面,將單一專性菌直接引入到混合菌種,存在微生物適應(yīng)性差,生長緩慢,或與土著菌競爭失利的問題.本試驗中,活性污泥存在能夠降解石油烴的專性菌系,由于長期暴露于污染環(huán)境中的土著微生物將進行自然選擇,因此通過活性污泥來馴化降解石油烴的專性菌系是合理的[15].這證實了把活性污泥作為菌源, 采用液相“中間產(chǎn)物-目標污染物”專性降解菌的雙底物馴化方式以獲得用于土壤修復(fù)的穩(wěn)定、健全的專性菌系的可行性.

表2 石油烴專性降解菌的分布Table 2 Identification of dominant bacteria capable of degrading petroleum hydrocarbons

2.2 石油烴專性菌系生長環(huán)境的優(yōu)化

2.2.1 最佳溫度的確定 適宜的溫度是專性菌系降解土壤石油烴的重要條件.溫度主要通過影響石油烴的物性和微生物自身活性來影響降解過程[16].如圖2所示,專性菌系在10～40℃范圍內(nèi)對石油烴均有一定的降解能力,其中當溫度為30～40℃時,處理72h后石油烴的降解率大于30%.較低溫度(10～20℃)下的降解率顯著低于較高溫度(30～40℃)時的降解率.較低溫度導(dǎo)致微生物酶活性的降低,進而抑制了微生物的生長,此外,低溫使石油烴黏度增大,難以被微生物充分利用,這導(dǎo)致石油烴降解率不高.Aislabie[17]等報道,升溫會增加碳氫化合物污染物的溶解度,使長鏈烷烴從固相轉(zhuǎn)移到水相并降低其黏度,提高了微生物對石油烴的利用率,有助于石油烴降解率的升高.處理72h后, 30℃時降解率達到42%,此時降解率最高.當溫度高于 30℃,石油烴降解率隨溫度的升高呈下降趨勢, 40℃時降解率下降至 33%,這可能是隨著溫度的升高,微生物的生長受到抑制從而影響其代謝過程.可以推測, 降解率在溫度為 30～35℃時最高,因此,專性菌系群降解石油烴的最適降解溫度為30～35℃.

圖2 不同溫度下石油烴降解率隨時間的變化Fig.2 Time-dependent changes of petroleum hydrocarbon degradation efficiency under different temperatures

2.2.2 最佳pH值的確定 關(guān)于pH值對專性菌系降解石油烴的影響如圖3所示.pH值為7時,石油烴的降解率最高(44%),pH值為9時,甚至低于 30%.pH值在 5～7范圍內(nèi)變化時,石油烴的降解率隨pH值升高逐漸增大. pH值大于7,石油烴降解率隨pH值的升高而減小.pH值為9時, 石油烴降解率最低.這是由于 pH值除了與微生物的生命活動有關(guān)外,還能對環(huán)境中有機物(如營養(yǎng)物質(zhì)和有機污染物)的離子化程度產(chǎn)生影響,進而間接影響微生物對石油烴的降解過程. 酸性條件下,H+會影響微生物膜的結(jié)構(gòu),因此,pH 值越低,微生物的膜結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定[18].堿性條件下,過多的 OH-會引起細胞膜上的電荷變化,阻礙細胞膜對營養(yǎng)物質(zhì)的運輸過程[19].此外,由于微生物對污染物的降解依賴于其產(chǎn)生的活性物質(zhì)(酶),過多的OH-和H+均會對酶活性產(chǎn)生影響,阻礙其正常代謝過程.因此,本研究菌群的最適 pH值為 7～8,專性菌系群適宜在中性以及偏微堿的土壤環(huán)境中生長.

圖3 不同初始pH值下石油烴降解率隨時間的變化Fig.3 Time-dependent changes of petroleum hydrocarbon degradation efficiency under different pH

2.2.3 最佳表面活性劑及其最適濃度的確定圖4(a)顯示,當吐溫80濃度低于或等于CMC(即0.25,0.5,1CMC)時,吐溫 80會抑制水土體系中石油烴的降解,高于 CMC(即 2.5,5CMC)時可以促進石油烴的降解.當吐溫80的濃度為5CMC時,石油烴的降解效率最高,為43%.這表示濃度大于CMC的吐溫80可以促進石油烴降解,較高濃度的吐溫80具有更好的石油烴降解性能.如圖4(b)所示,水土體系中石油烴的降解效率受SDS濃度的影響.當 SDS濃度為 2CMC時,石油烴降解效率最高,72h后達到31%.當SDS的濃度低于或高于 2CMC時,會抑制土壤石油烴的降解.當吐溫80和 SDS濃度為 5CMC(325mg/L)和 2CMC(5000mg/L)時,72h后石油烴降解效率最高(分別為42%和31%).結(jié)果表明,與添加SDS相比,添加吐溫 80后石油烴的降解效率更高,同時吐溫 80的投加量較少.因此,后續(xù)修復(fù)試驗選擇濃度為5CMC(375mg/L)的吐溫80.

進一步探討吐溫80和SDS在石油烴降解過程中的作用機制.當吐溫80的濃度低于CMC(即0.25,0.5CMC)時,石油烴的降解效率甚至低于對照組.由于濃度低于CMC的吐溫80不存在增溶作用,所以上述結(jié)果可能是由于吐溫80與石油烴之間存在碳源競爭作用.前期研究表明,吐溫 80可以作為專性菌系生長的碳源.這進一步證實,低濃度的吐溫80引起的碳源競爭作用會對石油烴的降解效果產(chǎn)生不利影響.當吐溫80的濃度超過CMC(即2,5CMC)時,除了吐溫80和石油烴之間的碳源競爭作用之外,水土體系中還存在增溶作用.增溶作用可促進石油烴降解,而碳源競爭作用會抑制石油烴降解.在這種情況下,石油烴降解效率明顯提高,遠高于對照組.這表明增溶作用引起的促進作用比碳源競爭作用引起的抑制作用更為顯著.與吐溫80不同的是,當SDS的濃度超過0.25CMC 時,會抑制專性菌系的生長.因此,當SDS濃度低于 CMC(即 0.25,0.5CMC)時,由于微生物抑制作用和碳源競爭作用等負面影響,石油烴的降解效率甚至低于對照組.當SDS濃度高于CMC時,增溶作用開始出現(xiàn).當 SDS濃度為2CMC 時,石油烴的降解效率最高.這表明,這種情況下增溶作用在石油烴降解過程中起主要作用.當 SDS濃度進一步增加時,微生物抑制作用隨之增強.這表明由微生物抑制作用和碳源競爭作用對石油烴降解效果造成的負面影響超過了溶解作用帶來的正面影響.盡管SDS可以提高石油烴的溶解度,但SDS的微生物抑制作用將導(dǎo)致降解石油烴的專性菌系失去降解功能.因此,石油烴降解效率降低,甚至低于對照組.綜上,石油烴在降解過程中受碳源競爭作用,表面活性劑增溶作用和微生物抑制作用的相互影響,這可能與表面活性劑的用量有關(guān).

圖4 水土體系中吐溫80、SDS濃度對石油烴降解率的影響Fig.4 Effects of concentrations of Tween 80and SDS on petroleum hydrocarbon degradation in water-soil system

2.3 吐溫 80-專性菌系聯(lián)合技術(shù)修復(fù)石油污染土壤試驗

進一步進行土壤修復(fù)試驗,以評估采用吐溫80-專性菌系聯(lián)合修復(fù)技術(shù)的可行性.圖5為修復(fù)過程中石油烴的降解率隨時間的變化.對于S0組(即未處理的土壤),僅有5.4%的石油烴被降解,這可能是由于其中的短鏈烴物質(zhì)具有揮發(fā)性且易被氧化.在整個修復(fù)試驗中,S1組(只接種專性菌系)的降解效率(49%)顯著高于S0組,表明專性菌系能夠迅速適應(yīng)石油污染的新環(huán)境,并表現(xiàn)出較高的石油烴降解能力.與S0和S1組相比,S2組(接種專性菌系同時投加吐溫 80)降解效率(77%)明顯提高.如上所述,吐溫 80在提高石油烴的溶解度方面發(fā)揮了重要作用,從而提高了石油烴對專性菌系的生物可得性.S2組石油烴較高的降解率可能是由于微生物的快速增殖.修復(fù)試驗前40d,S1,S2組降解效率相較于S0提高得更快.這是由于適應(yīng)期中,污染土壤中碳源供應(yīng)充足,微生物可以降解石油烴中的短鏈或直鏈烯烴.第 40d到第 80d,降解效率曲線趨于平緩,可能的原因如下:(1)易降解的石油烴已經(jīng)被專性菌系完全消耗[20];(2)可能產(chǎn)生并積累了有毒中間代謝物或副產(chǎn)物[21];(3)隨著碳源的消耗,專性菌系的活性明顯降低.土壤修復(fù)試驗 80d后在自然光中可以清晰看到 S0組污染土壤的樣品仍為黑色塊狀.S2組土壤顏色呈黃色,質(zhì)地疏松.在 S1和 S2組土壤樣品中未觀察到油污結(jié)塊土.進一步表明,這些樣品的石油烴污染程度得到有效的緩解.

與S0組相比,S1組的結(jié)果表明,馴化后的專性菌系可以有效降解石油烴,從而證實了采用活性污泥作為菌源以獲得土壤修復(fù)專性菌系的可行性.與S1組相比,S2組的結(jié)果表明,加入吐溫80可以提高石油烴的降解率.上述試驗結(jié)果證實,短期內(nèi),石油烴降解效率的提高主要來自吐溫80的增溶作用.與S0和S1組相比,S2組的結(jié)果表明,吐溫 80-專性菌系聯(lián)合修復(fù)技術(shù)在石油烴污染土壤修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用前景.

圖5 80d修復(fù)過程中石油烴降解率隨時間變化Fig.5 Time-dependent changes of petroleum hydrocarbon degradation efficiency during 80days' bioremediation time

3 結(jié)論

3.1 采用“鄰苯二酚-石油烴”雙底物馴化模式,得到了石油烴的專性降解菌系,經(jīng)高通量測序可知,馴化后的專性降解菌系以產(chǎn)黃桿菌屬(Rhodanobacter sp.)為主,占比 41.0%.專性菌系具有生物降解石油烴的性能,培養(yǎng)80d后,石油烴降解率可達49%.

3.2 溫度為 30～35℃,pH 值為 7～8 時,專性菌系對土壤石油烴的降解效果最好.

3.3 吐溫 80對石油烴降解的促進作用優(yōu)于SDS.當吐溫 80的濃度為 5CMC(即 375mg/L)時石油烴的降解效率最高,可達42%.進一步研究發(fā)現(xiàn)吐溫80在石油烴降解過程中增溶作用占主導(dǎo)作用,而不是碳源競爭作用.3.4 最優(yōu)條件下,同時接種專性菌系并投加吐溫80d后石油烴降解率高達77%,比僅接種專性菌系或僅投加吐溫80時石油烴的降解效率更高,證實利用吐溫 80-專性菌系聯(lián)合修復(fù)技術(shù)進行石油烴污染土壤修復(fù)的可行性.

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