侯 穎,李靜泉,尤曉顏,王維宇,裴 韜,孫軍杰 (內(nèi)蒙古大學生態(tài)與環(huán)境學院,內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境污染控制與廢物資源化重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 000；河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽4703)

精喹禾靈,化學名稱(R)-2-[4-(6-氯喹喔啉-2-基氧)苯氧基]丙酸乙酯,屬芳氧苯氧丙酸類,內(nèi)吸傳導型選擇性莖葉處理除草劑,其作用機制是抑制禾本科植物分生組織的細胞脂肪酸合成[1].隨著精喹禾靈毒理研究的開展,越來越多的報道顯示,精喹禾靈對植物、動物及人類安全產(chǎn)生了嚴重影響.有研究表明:精喹禾靈對植物具有一定的遺傳毒性和基因毒性[2-3];對動物除具有急性毒性以外[4-5],還具有較強的慢性毒性和生殖毒性,如精喹禾靈可引起斑馬魚心臟畸形[5],誘導人淤膽型和肝細胞混合型的肝損傷[6],對大鼠睪丸生精細胞具有損傷作用等[7-8].因此,精喹禾靈在加拿大等國家被限定殘留量[9],歐盟甚至禁止其使用[10],但在我國精喹禾靈仍被廣泛生產(chǎn)和使用.

土壤微生物對精喹禾靈在土壤環(huán)境中的降解發(fā)揮著重要作用[11],土壤中微生物越多,精喹禾靈在土壤中降解越快[12],因此利用微生物降解進行精喹禾靈污染的環(huán)境修復成為一種非常有效的手段.近年來,已有多種能夠降解精喹禾靈的微生物菌株從土壤中分離出來,如 Pseudomonas sp. L1[13]、Bacillus pumilis[14]、Rhodococcus sp.J-3[15]、Rhodococcus sp. JT-3[16]和 Ochrobactrum sp. QE-9[17].此外,在關于其他芳氧苯氧丙酸類除草劑微生物降解的報道中,菌株 Pseudomonas azotoformans QDZ-1[18]、Rhodococcus sp. T1[19]、Acinetobacter sp. DL-2[20]和Rhodococcus ruber JPL-2[21]等對精喹禾靈也有一定的降解能力.本研究以精喹禾靈為唯一碳源,從長期受精喹禾靈污染的土壤中篩選到 1株精喹禾靈降解菌Bacillus subtilis H,并詳細研究了該菌株對精喹禾靈的降解特性和降解機制,這是首次關于枯草芽孢桿菌降解精喹禾靈的研究.

關于利用 Bacillus subtilis進行環(huán)境污染生物修復的報道已有很多,如Bacillus subtilis能夠修復石油污染[22]、降解農(nóng)藥 DDT[23]等.Bacillus subtilis在土壤中廣泛存在,生長速度快,抗逆性強并可以分泌多種酶,這些特性使其成為修復環(huán)境污染的理想微生物.提過的精喹禾靈樣品,于常溫常壓下?lián)]發(fā)至干,加入1mL色譜純甲醇溶解剩余物,并用0.22μm有機濾膜過濾后利用 HPLC檢測.液相色譜條件:4.6mm×250mm C18反相色譜柱;流動相為80%甲醇,流速為 1mL/min,上樣量為 10μL,柱溫為30℃ .Waters 2487紫外檢測器,檢測波長為235nm.

1 材料與方法

1.1 土樣

江蘇省某農(nóng)藥廠長期受精喹禾靈污染的土壤.

1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB 培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 5.0,胰蛋白胨 10.0,NaCl 10.0,pH值自然.

無機鹽培養(yǎng)基(MSM,g/L):NH4NO31.0,KH2PO40.5, K2HPO41.5,NaCl 1.0, MgSO4·7H2O 0.1,pH 7.0.

富集培養(yǎng)基:無機鹽培養(yǎng)基中添加 20mg/L酵母汁作為生長因子.

精喹禾靈(94.2%)原藥由安徽華星化工有限公司贈送.

1.3 精喹禾靈的檢測及降解產(chǎn)物的鑒定

高效液相色譜(HPLC)檢測:取 5mL培養(yǎng)液,用10%HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值至2.0后,加入等體積二氯甲烷,劇烈震蕩 1min,靜置 10min,去水相,加無水硫酸鈉去除有機相中殘余水分.取1mL抽

精喹禾靈降解產(chǎn)物的鑒定采用 UPLC-MS.色譜系統(tǒng):Waters ACQUITY UPLC M-Class.色譜柱:Acquity BEH C18(2.1mm×50mm,1.7pm);柱溫30℃;進樣量 5μL;流動相:乙腈-0.1%甲酸(體積比70:30);流速0.2mL/min.

質(zhì)譜系統(tǒng):Waters XEVO-TQS micro.離子源ESI,毛細管電壓5.0kV,離子源溫度120℃,脫溶劑氣溫度 500℃,錐孔反吹氣流量 50L/h,脫溶劑氣流量800L/h,錐孔壓力30kV,碰撞能量20eV,檢測器為XDRTM,m/z掃描范圍為50～600,正離子掃描模式.

1.4 精喹禾靈降解菌的富集與分離

在100mL含50mg/L精喹禾靈的富集培養(yǎng)基中加入10g土樣,于30℃,180r/min培養(yǎng)7d.按1.3所述方法測定富集液有降解效果后,吸取 10mL富集液轉(zhuǎn)移至新鮮富集培養(yǎng)基中,連續(xù)富集.待富集液降解效果穩(wěn)定后,采用稀釋平板法,將稀釋后的富集液涂布于含200mg/L精喹禾靈的LB固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48h后,凡是菌落周圍有透明圈的菌株即為要分離的精喹禾靈降解菌.對分離到的菌落形態(tài)不同的精喹禾靈降解菌進行劃線純化后,挑取其單菌落接種于含100mg/L精喹禾靈的無機鹽培養(yǎng)基中,30℃,180r/min培養(yǎng),24h后取樣測定培養(yǎng)基中精喹禾靈的殘留量,選取降解效果最好的菌株H作為進一步研究對象.

1.5 菌株H的初步鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[24]對菌株H進行菌落、菌體形態(tài)觀察和生理生化試驗.

菌株 16S rRNA基因序列分析:采用菌落PCR技術擴增降解菌株16S rRNA基因序列.引物為細菌 16S rRNA 基因通用引物 27f:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Escherichia coli bases 8to 27)和 1492r:5’-TACCTTGTTAC-GACTT-3’(Escherichia coli bases 1507to 1492).擴增反應體系:10×TaqDNA聚合酶反應緩沖液5μL,dNTP(20mmol/μL) 4μL,引物(25pmol/μL)各2μL,Mg2+(25mmol/μL) 4μL,菌體少量,TaqDNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL,加滅菌雙蒸水至 50μL;反應條件:95℃變性 5min,95 ℃ 30s,55 ℃ 30s,72℃1.5min,30個循環(huán);最后72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物經(jīng) 0.75%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序.將測定的菌株16S rDNA序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行在線比對分析,并在 Ribosomal Database Project(RDP)數(shù)據(jù)庫中下載與降解菌株16S rRNA基因序列同源的序列,最后,采用 MEGA6.0軟件構建降解菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.6 菌株H對精喹禾靈的降解

將菌株H在液體LB培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)12h后,5000r/min離心5min收集菌體,用滅菌的 MSM 培養(yǎng)基洗滌一次后,制成 OD600nm=1.0的種子液.將種子液按 5%接種量接種到含100mg/L精喹禾靈的MSM中,于37℃、180r/min搖床培養(yǎng),每隔24h取樣一次,利用HPLC測定培養(yǎng)液中精喹禾靈的含量,同時采用稀釋平板法測定培養(yǎng)液中菌株 H的數(shù)量,確定菌株H對精喹禾靈的降解能力及利用精喹禾靈的生長情況.另外,在不同溫度(20、25、30、37、42℃)、不同初始 pH 值(5、6、7、8、9、10)、不同精喹禾靈初始濃度(25、50、100、200mg/L)、不同接種量(0.5%、1%、5%和10%)以及添加各種金屬離子(0.5mmol/L)條件下測定菌株H對精喹禾靈的降解特性.

2 結果與討論

2.1 精喹禾靈降解菌的分離與鑒定

利用以精喹禾靈為唯一碳源的富集培養(yǎng)基,從采集的土樣中分離到一株精喹禾靈降解菌,命名為菌株 H.該菌株在含精喹禾靈的 LB固體培養(yǎng)基上能形成明顯的水解圈(圖 1a),其菌落呈污白色,扁平,不透明,邊緣不整齊(圖 1a).對其菌體進行簡單染色后,在顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)其菌體為長桿狀,有芽孢,無莢膜(圖1b).生理生化試驗結果表明:菌株H的接觸酶試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、酯酶試驗和明膠液化試驗均為陽性,V-P試驗為陰性.

利用細菌 16S rRNA基因通用引物 27f和1492r對菌株H的16S rRNA基因進行PCR擴增和測序后,將其基因序列提交GenBank,獲得其登錄號為MF574323.通過BLAST比對,表明菌株H的16S rRNA基因與Bacillus subtilis strain Bs_TC6的16S rRNA基因(登錄號:KY575578)相似度最高,達到 100%.利用 RDP數(shù)據(jù)庫的Sequence Match分析和MEGA 6.0構建其系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖2所示.結果表明:菌株H與枯草芽孢桿菌模式菌株DSM10(登陸號:AJ276351)位于同一分支,說明二者親緣關系最近.綜合菌株H的形態(tài)特征、生理生化特性,將菌株H確定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis).2.2 菌株H以精喹禾靈為唯一碳源的降解曲線及降解產(chǎn)物鑒定

圖1 菌株H菌落與菌體形態(tài)(1000×)Fig.1 Morphology of colony and cell of strain H (1000×)

將菌株 H種子液按 5%接種量接種到含100mg/L精喹禾靈的無機鹽培養(yǎng)基中后,定時取樣測定精喹禾靈的濃度,并在接種0h和96h利用平板菌落計數(shù)法測定培養(yǎng)基中活菌數(shù)量,結果如圖3所示.由圖3可以看出,菌株H具有很強的降解精喹禾靈的能力,在24h即可將100mg/L精喹禾靈降解 70%左右,之后降解速度開始降低,72h以后即可將 100mg/L的精喹禾靈降解 98.94%.菌株 H對精喹禾靈的降解動力學方程為y=111.0868e-0.0505x(r=0.9436,P<0.05).與已報道的其他種屬細菌相比,枯草芽孢桿菌H的降解能力較強,如已報道的Pseudomonas屬細菌需要4～9d才能將 50mg/L的精喹禾靈降解 90%以上[11].此外枯草芽孢桿菌還具有生長速度快、易培養(yǎng)、對環(huán)境適應力強、對人畜安全等特點,使其在環(huán)境污染物的生物處理和修復中更具有優(yōu)勢.枯草芽孢桿菌平板菌落計數(shù)結果表明,在接種0h和96h后培養(yǎng)液中菌株H的活菌細胞數(shù)分別為4.5×107和3.7×108cfu/mL,這說明菌株H能以精喹禾靈為唯一碳源進行生長.

圖2 菌株H的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain H

圖3 菌株H對精喹禾靈的降解曲線Fig.3 Degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

利用HPLC分析發(fā)現(xiàn),未接種菌株H的對照培養(yǎng)基中僅有一個精喹禾靈的特征峰,其保留時間為13.365min(圖4a);而在接種菌株H的培養(yǎng)基中除了有精喹禾靈的特征峰外,還有一個特征峰,其保留時間為 3.678min,并且其濃度隨著精喹禾靈濃度的降低而升高,推測其為精喹禾靈的代謝產(chǎn)物(圖4b).收集該產(chǎn)物,對其進行UPLC-MS鑒定,發(fā)現(xiàn)其 m/z=345,并且該物質(zhì)可產(chǎn)生m/z=91、121、272和299的碎片離子(圖4d),結合精喹禾靈的 UPLC-MS圖譜和碎片離子情況(圖 4c),推測該代謝產(chǎn)物為精喹禾靈酸.進一步研究表明,菌株H不能降解精喹禾靈酸,即菌株H是通過斷裂精喹禾靈分子中丙酸和乙醇之間的酯鍵使其降解的,這與菌株H酯酶試驗為陽性相吻合.關于微生物降解芳氧苯氧丙酸類除草劑的報道中,大多數(shù)菌株是通過分泌酯酶使除草劑酯鍵斷裂形成相應的酸[17-21];而此類除草劑完全礦化往往需要多種微生物的共同作用[16,25],因此還需進一步分離和篩選完全降解精喹禾靈的菌株.

圖4 精喹禾靈及其降解產(chǎn)物的高效液相色譜和質(zhì)譜Fig.4 High performance liquid chromatography and mass spectrometry of quizalofop-p-ethyl and its degradation product

2.3 溫度和初始pH值對菌株H降解精喹禾靈的影響

圖5 溫度對菌株H降解精喹禾靈的影響Fig.5 Effect of temperature on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

溫度和 pH值不僅是影響微生物生長的重要環(huán)境因素,也是影響微生物降解污染物酶促反應的重要環(huán)境條件.溫度對菌株 H降解精喹禾靈的影響結果如圖5所示,菌株H在30～42℃范圍內(nèi)對精喹禾靈的降解率均達到 95%以上,而當溫度范圍在20～25℃范圍內(nèi)時,菌株H對精喹禾靈的降解能力較低,但72h時仍然可以達到80%以上的降解率.出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是菌株 H為芽孢菌,無論是其菌體還是其產(chǎn)生的降解酶都比較耐熱,所以即使在 42℃時仍然有很高的降解能力.而當溫度處在20～25℃范圍內(nèi),菌株 H的生長和酶促反應反而受到一定的抑制.pH值對菌株H降解精喹禾靈的影響如圖6所示,菌株H在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)對精喹禾靈的降解效果沒有太大的變化,其降解率均在 90%以上,說明菌株 H可以適應大多數(shù)自然環(huán)境下的酸堿度而發(fā)揮降解功能.

圖6 初始pH值對菌株H降解精喹禾靈的影響Fig.6 Effect of initial pH value on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

2.4 精喹禾靈初始濃度對菌株H降解能力的影響

在無機鹽培養(yǎng)基中分別加入初始濃度為25、50、100、200mg/L的精喹禾靈,按5%接種量接入菌株H種子液,定時取樣,測定菌株H在不同底物濃度下的降解能力,結果如圖7所示.由圖7可以看出,雖然隨著底物濃度的升高,精喹禾靈所需要的降解時間不斷延長,但對菌株 H總的降解能力影響不大,即使精喹禾靈初始濃度為 200mg/L,其在72h內(nèi)的降解率仍然達90%以上,這說明菌株H對高濃度的精喹禾靈有較強的耐受力.

圖7 精喹禾靈初始濃度對菌株H降解能力的影響Fig.7 Effect of initial quizalofop-p-ethyl concentration on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

2.5 接種量對菌株H降解精喹禾靈的影響

在含有 100mg/L精喹禾靈的無機鹽培養(yǎng)基中,分別接入0.5%、1%、5%和10%的菌株H 種子液,然后定時取樣,測定精喹禾靈在不同接種量條件下的降解情況.結果如圖8所示,接種量對精喹禾靈的降解速率有較大影響,隨著接種量的增加,精喹禾靈的降解速率明顯增大;但即使在接種量較低時(0.5%和1%),72h內(nèi)精喹禾靈的降解率仍然達98%以上,該結果進一步表明菌株H對精喹禾靈有很強的降解能力.

圖8 接種量對菌株H降解精喹禾靈的影響Fig.8 Effect of inoculum size on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

2.6 金屬離子對菌株H降解精喹禾靈的影響

圖9 金屬離子對菌株H降解精喹禾靈的影響Fig.9 Effect of metal ions on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

菌株 H主要是利用其產(chǎn)生的酶對精喹禾靈進行降解,很多金屬離子對酶的活性有影響,因此,對常見金屬離子對菌株 H降解精喹禾靈的影響進行了研究.由圖9可以看出,Co2+對菌株H降解精喹禾靈有強烈的抑制作用,在其影響下菌株 H在72h內(nèi)對精喹禾靈的降解率僅有20%,其原因可能是Co2+對菌株H的生長以及其產(chǎn)生的酶有強烈的抑制作用.其次Mn2+對菌株H降解精喹禾靈有輕微抑制作用,而其它金屬離子對菌株H降解精喹禾靈的促進和抑制作用均不明顯.

3 結論

3.1 從采集的土樣中分離出一株精喹禾靈高效降解菌株H,經(jīng)生理生化和16S rRNA基因序列分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis).

3.2 菌株 H 能以精喹禾靈為唯一碳源生長,在37℃,pH8.0條件下,72h內(nèi)可將100mg/L的精喹禾靈降解98%.

3.3 菌株 H 在溫度為 30～42℃和 pH6～10范圍內(nèi)均可有效降解精喹禾靈;在精喹禾靈濃度≤200mg/L時,其濃度對菌株 H的降解能力影響不大;菌株H降解能力較強,即使低接種量(0.5%)仍然可以很好的降解精喹禾靈.

3.4 Co2+對菌株H降解精喹禾靈有明顯的抑制作用,Mn2+對菌株H降解精喹禾靈有輕微抑制作用.

3.5 菌株H降解精喹禾靈的產(chǎn)物為精喹禾靈酸,即菌株 H降解精喹禾靈的機制是其分泌酯酶使精喹禾靈分子中丙酸和乙醇之間的酯鍵斷裂.

參考文獻：

[1]Mantzos N, Karakitsou A, Nikolaki S, et al. Dissipation and transport of quizalofop-p-ethyl herbicide in sunflower cultivation under field conditions [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016,23(4):3481-3490.

[2]Mustafa Y, Arikan E S. Genotoxicity testing of quizalofop-P-ethyl herbicide using the Allium cepa anaphase-telophase chromosome aberration assay [J]. Caryologia, 2008,61(1):45-52.

[3]Doganlar Z B. Quizalofop-p-ethyl-induced phytotoxicity and genotoxicity in Lemna minor and Lemna gibba [J]. Journal of Environmental Science and Health, Part A: Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineering, 2012,47(11):1631-1643.

[4]趙小會,程翠利,周春姣,等.10%精喹禾靈乳油對斑馬魚的急性毒性試驗 [J]. 廣州化工, 2016,44(16):108-110.

[5]朱麗珍.兩種芳氧苯氧基丙酸酯類除草劑對斑馬魚毒性效應及作用機制研究 [D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學, 2016.

[6]Elefsiniotis I S, Liatsos G D, Stamelakis D, et al. Mixed Cholestatic/Hepatocellular liver injury induced by the herbicide quizalofop-p-ethyl [J]. Environmental Health Perspectives,2007,115(10):1479-1481.

[7]陳日萍,陳 彤,俞少勇,等.芳氧苯氧丙酸類除草劑對大鼠睪丸生精細胞的損傷作用 [J]. 浙江省醫(yī)學科學院學報, 2006,4:22-25.

[8]陳日萍,高 明,蔡冬苗,等.精喹禾靈亞慢性經(jīng)口暴露對雄性大鼠的生殖毒性研究 [J]. 毒理學雜志, 2011,25(3):208-211.

[9]中國質(zhì)量新聞網(wǎng).加拿大確定乙基精喹禾靈等農(nóng)殘最大殘留限量 [EB/OL]. http://www.cqn.com.cn/news/zjpd/spaq/1133795.html, 2016-03-22.

[10]鄒榮仟,吳德杰,吳 林,等.精喹禾靈乳油在越橘果實及土壤中的殘留動態(tài) [J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報, 2009,31(5):652-655.

[11]湯富彬.精喹禾靈的土壤微生物降解 [D]. 杭州:浙江大學, 2002.

[12]王曉環(huán),王德飄,康 頔,等.影響精喹禾靈在土壤中降解的因素研究 [J]. 遼寧化工, 2016,(5):540-543.

[13]呂 欣,彭霞薇,呼 慶,等.利用DGGE-菌落原位雜交法分離土壤中精喹禾靈降解菌 [J]. 環(huán)境科學, 2013,34(1):263-270.

[14]周麗興,萬樹青,陳澤鵬,等.短小芽孢桿菌(Bacillus pumilis)對精喹禾靈的降解特性 [J]. 農(nóng)藥, 2006,45(9):627-629.

[15]李夢雅,李 杰,戴 純,等.一株高效精喹禾靈降解菌的篩選、鑒定及降解特性研究 [J]. 基因組學與應用生物學, 2017,(2):686-692.

[16]Zhang H, Li M, Li J, et al. A key esterase required for the mineralization of quizalofop-p-ethyl by a natural consortium of Rhodococcus sp JT-3and Brevundimonas sp JT-9 [J]. Journal of Hazardous Materials, 2017,327:1-10.

[17]Zhang H, Li M, Dai C, et al. Characterization of EstQE, a new member of esterase family VIII from the quizalofop-P-ethyldegrading bacterium Ochrobactrum sp QE-9 [J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 2016,133:167-175.

[18]Nie Z J, Hang B J, Cai S, et al. Degradation of cyhalofop-butyl(CyB) by Pseudomonas azotoformans strain QDZ-1, and cloning of a novel gene encoding CyB-hydrolyzing esterase [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011,59:6040-6046.

[19]Hou Y, Tao J, Shen W J, et al. Isolation of the fenoxaprop-ethyl (FE)-degrading bacterium Rhodococcus sp. T1, and cloning of FE hydrolase gene feh [J]. FEMS Microbiology Letters, 2011,323(2):196-203.

[20]Dong W L, Sheng J, Shi K, et al. Biodegradation of fenoxaprop-P-ethyl (FE) by Acinetobacter sp. strain DL-2and cloning of FE hydrolase gene afeH [J]. Bioresource Technology, 2015,186:114-121.

[21]Liu H M, Lou X, Ge Z J, et al. Isolation of an aryloxyphenoxy propanoate (AOPP) herbicide-degrading strain Rhodococcus ruber JPL-2and the cloning of a novel carboxylesterase gene (feh)[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2015,46(2):425-432.

[22]Bezza F A, Chirwa E M N. Production and applications of lipopeptide biosurfactant for bioremediation and oil recovery by Bacillus subtilis CN2 [J]. Biochemical Engineering Journal, 2015,101:168-178.

[23]Sariwati A, Purnomo A S, Kamei I. Abilities of co-cultures of brown-rot fungus Fomitopsis pinicola and Bacillus subtilis on biodegradation of DDT [J]. Current Microbiology, 2017,(4):1-8.

[24]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊 [M]. 北京:科學出版社, 2001.

[25]Dong W L, Hou Y, Xi X D, et al. Biodegradation of fenoxaprop- ethyl by an enriched consortium and its proposed metabolic pathway [J].International Biodeterioration & Biodegradation, 2015,97:159-167.