羅紅霞,李曉紅,田文靜,張 俊,王 建,林少華

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102442;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué),江西南昌 330045)

植物乳桿菌作為益生菌,對(duì)人類和動(dòng)物健康有著重要的促進(jìn)作用[1],如調(diào)節(jié)胃腸道生態(tài)平衡、增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇高血壓和抑制腫瘤前體物質(zhì)形成等功能[2-5]。目前,已廣泛應(yīng)用于保健品、功能性食品、微生態(tài)添加劑等的研發(fā)和使用[6-7]。雖然植物乳桿菌的功效已經(jīng)得到不少專家證實(shí),但卻難以有足夠數(shù)量的活菌到達(dá)腸道而發(fā)揮作用。其主要原因是植物乳桿菌到達(dá)胃腸道消化系統(tǒng)后,受到胃酸、膽汁和其他一些消化酶等的影響而喪失活性[8-9]。

而微膠囊技術(shù)是提高乳酸菌存活率的一項(xiàng)高新技術(shù)[10-11],它能達(dá)到較好的緩釋效果[12],成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。常用的微膠囊制備方法主要包括:噴霧干燥法、擠壓法、乳化法、凝聚法、流化床包埋空氣懸浮法和靜電法等[13-14]。噴霧干燥是在干燥室中將物料霧化,再利用熱空氣將物料中水分迅速汽化,得到干燥產(chǎn)品[15]。該方法具有成本低廉、適用性廣泛、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn),更適合工業(yè)化推廣應(yīng)用[16-17]。韓冬冬等[18]利用噴霧干燥法對(duì)土壤石油中污染生物修復(fù)的革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行微膠囊化后,菌的活性和穩(wěn)定性得到有效提高。

蛋白質(zhì)如小麥蛋白、牛奶蛋白、乳清蛋白和明膠常用作微膠囊的壁材[19-21]。乳清蛋白和明膠是在食品工業(yè)中被廣泛使用的材料,其來(lái)源廣泛,無(wú)毒無(wú)害,價(jià)格低廉,具有良好的生物相容性。

本實(shí)驗(yàn)以乳清蛋白和明膠為復(fù)合壁材,利用噴霧干燥和生物微膠囊技術(shù),將青貯飼料中優(yōu)良植物乳桿菌進(jìn)行包埋,并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌微膠囊工藝,以期提高該菌體在胃腸道消化系統(tǒng)中的存活率。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菌種 采自河北省廊坊市固安縣天然發(fā)酵玉米青貯飼料;乳清蛋白(食品級(jí))、明膠(分析純)、MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、磷酸氫二鉀(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、胰蛋白酶(酶活力≥2500.0 U/mg) 北京化學(xué)試劑公司。

LDZF-30KB-II型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;普通光學(xué)顯微鏡55i 日本OYLMPUS;PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;DT502A電子天平 常熟市砝碼儀器有限公司;L-117型噴霧干燥器 北京來(lái)亨科貿(mào)有限責(zé)任公司;R134A離心機(jī) 德國(guó)EPPENDORF。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物乳桿菌的活化 依據(jù)文獻(xiàn)[22]中的方法將植物乳桿菌,按3%的接種量,接種于30 mL的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱,靜置培養(yǎng)24 h,同樣方法重復(fù)2次活化,使菌種活力達(dá)到0.6以上,備用。

1.2.2 菌懸液制備 將活化好的植物乳桿菌按3%的接種量,接種于30 mL的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,于4000 r/min離心5 min,4 ℃后、收集菌體,再用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液的濃度為5.12×109cfu/mL,于4 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 微膠囊包埋工藝 取一定量的按照參照文獻(xiàn)[23]配制好的乳清蛋白溶液,于40 ℃ 加熱,置于攪拌器中攪拌,4000 r/min高速分散 10 min至完全溶解,靜置待泡沫消去后加入20 mL在1.2.2中制備的植物乳桿菌菌懸液,于40 ℃ 加熱、攪拌(500 r/min,5 min)攪拌,同時(shí)加入一定量的明膠溶液攪拌均勻。置于均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)(25 MPa、50 ℃)設(shè)置一定的進(jìn)料速度與進(jìn)風(fēng)溫度,最后噴霧干燥器制備植物乳桿菌微膠囊。

1.2.4 人工腸液配制 稱取磷酸氫二鉀3.4 g,加入250 mL的蒸餾水溶解,再用0.1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到6.8,另外,取5 g胰蛋白酶,用適量蒸餾水將其溶解,再將兩溶液混合均勻,最后用蒸餾水定容至500 mL,于4 ℃下儲(chǔ)藏備用。

1.2.5 微膠囊單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 壁材配比對(duì)包埋植物乳桿菌包埋率的影響 在壁材添加量為 15%,進(jìn)風(fēng)溫度為120 ℃,進(jìn)料量為25%,壁材質(zhì)量配比(乳清蛋白:明膠)分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5的情況下,考察植物乳桿菌微膠囊包埋率隨壁材配比變化的影響。

1.2.5.2 壁材添加量對(duì)包埋植物乳桿菌包埋率的影響 在壁材配比(乳清蛋白與明膠質(zhì)量比)為1∶1.5,進(jìn)風(fēng)溫度為120 ℃,進(jìn)料量為25%,壁材添加量分別為10%、15%、20%、25%的情況下,考察植物乳桿菌微膠囊包埋率隨壁材用量變化的影響。

1.2.5.3 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)包埋植物乳桿菌包埋率的影響 在壁材配比(乳清蛋白與明膠質(zhì)量比)為1∶1.5,壁材添加量為20%,進(jìn)料量為25%,進(jìn)風(fēng)溫度分別為110、120、130、140 ℃的情況下,考察植物乳桿菌微膠囊包埋率隨進(jìn)風(fēng)溫度變化的影響。

1.2.5.4 進(jìn)料量對(duì)包埋植物乳桿菌包埋率的影響 在壁材配比(乳清蛋白與明膠質(zhì)量比)為1∶1.5,壁材添加量20%、進(jìn)風(fēng)溫度為120 ℃,進(jìn)料流量分別為20%、25%、30%、35%的情況下,考察植物乳桿菌微膠囊包埋率隨進(jìn)料量變化的影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)影響植物乳桿菌包埋率的四個(gè)因素壁材配比、壁材添加量、進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料量設(shè)計(jì)三水平優(yōu)化實(shí)驗(yàn),如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼表Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels coding table

1.2.7 植物乳桿菌包埋率測(cè)定 取噴霧干燥后的微膠囊樣品1 g,置于99 mL人工腸液(pH=6.8),于37 ℃恒溫振蕩器振蕩45 min后,活菌計(jì)數(shù)[24-25]。

菌體包埋率(%)=1 g樣品中的活菌總數(shù)×所得樣品質(zhì)量/噴霧干燥前加入的植物乳桿菌的活菌總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Excel和Design-Expert 8.0.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 壁材配比(乳清蛋白與明膠質(zhì)量比)對(duì)包埋植物乳桿菌包埋率的影響 從圖1中可以看出,隨著壁材配比(乳清蛋白與明膠質(zhì)量比)的比值減小,包埋率先增加后降低,當(dāng)乳清蛋白與明膠的質(zhì)量比為1∶1.5時(shí),植物乳桿菌微膠囊的包埋率最高,達(dá)到60.3%,初步確定壁材配比(乳清蛋白與明膠質(zhì)量比)為1∶1.5作為響應(yīng)面優(yōu)化條件。

圖1 壁材配比(乳清蛋白∶明膠)對(duì)包埋率的影響Fig.1 Effect of the ratio of wall material on encapsulation yield注：*表示與本因素水平1的結(jié)果相比，包埋率有顯著影響(p<0.05)，圖2～圖4同。

2.1.2 壁材添加量對(duì)植物乳桿菌包埋率的影響 從圖2中可以看出,隨著壁材添加量的增加,包埋率先增加后降低,壁材添加量為20%時(shí),植物乳桿菌微膠囊包埋率最高,達(dá)到58.7%;當(dāng)壁材添加量<20%時(shí),由于壁材量不足,使植物乳桿菌暴露在外,在噴霧干燥過(guò)程中,會(huì)導(dǎo)致包埋效果變差。因此,初步確定壁材添加量為20%作為響應(yīng)面優(yōu)化條件。

圖2 壁材添加量對(duì)包埋率的影響Fig.2 Effect of wall material on encapsulation yield

2.1.3 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)包埋植物乳桿菌包埋率的影響 從圖3中可以看出,隨著進(jìn)風(fēng)溫度的增加,包埋率先增加后降低,當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度為120 ℃時(shí),植物乳桿菌微膠囊包埋率最高,達(dá)到62.7%,超過(guò)或低于該溫度,均影響微膠囊包埋率。因此,初步確定進(jìn)風(fēng)溫度為120 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化條件。

圖3 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)包埋率的影響Fig.3 Effect of the inlet air temperature on encapsulation yield

2.1.4 進(jìn)料量對(duì)包埋植物乳桿菌包埋率的影響 從圖4中可以看出,隨著進(jìn)料量的增加,包埋率先增加后降低,進(jìn)料量為30%時(shí),植物乳桿菌微膠囊包埋率最高,達(dá)到52%,當(dāng)進(jìn)料量<30%,由于塔內(nèi)的進(jìn)風(fēng)溫度不變,過(guò)少的進(jìn)料量會(huì)使植物乳桿菌受到高溫的傷害,導(dǎo)致活性降低,但當(dāng)進(jìn)料量超過(guò)30%時(shí),過(guò)高的進(jìn)料量會(huì)使塔內(nèi)的含水量增加,影響植物乳桿菌在微膠囊內(nèi)的穩(wěn)定性,使其包埋率下降。因此,初步確定進(jìn)料量為30%作為響應(yīng)面優(yōu)化條件。

圖4 進(jìn)料量對(duì)包埋率的影響Fig.4 Effect of the feed rate on encapsulation yield

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到各因素對(duì)植物乳桿菌微膠囊包埋率的二次回歸方程為:

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

Y(%)=58.97-3.01A+4.55B+3.43C+1.41D+1.17AB+1.22AC+0.43AD+0.48BC-2.05BD+1.73CD-4.67A2-3.38B2-3.52C2+0.20D2。

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3,模型的p小于0.01,說(shuō)明該二次回歸方程具有高度的顯著性,失擬項(xiàng)p=0.1133>0.05,說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)實(shí)際擬合良好,實(shí)驗(yàn)誤差小,較好地反映了植物乳桿菌微膠囊包埋率與壁材配比、壁材添加量、進(jìn)風(fēng)溫度和進(jìn)料量的關(guān)系。一次項(xiàng)中A、B、C對(duì)包埋率的影響極顯著(p<0.01),二次項(xiàng)中除D2不顯著(p>0.05)外,其余的二次項(xiàng)都顯著,交互項(xiàng)不顯著(p>0.05)。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Regression model analysis of variance results

2.3 交互效應(yīng)分析

為了探討交互作用的影響,使其中的兩個(gè)因素固定為0水平,得到交互效應(yīng)方程分別為:

Y(A、B)(%)=558.97-3.01A+4.55B+1.17AB-4.67A2-3.38B2

Y(A、C)(%)=558.97-3.01A+3.43C+1.22AC-4.67A2-3.52C2

Y(A、D)(%)=558.97-3.01A+1.41D+0.43AD-4.67A2+0.20D2

Y(B、C)(%)=558.97+4.55B+3.43C+0.48BC-3.38B2-3.52C2

Y(B、D)(%)=558.97+4.55B+1.41D-2.05BD-3.38B2+0.20D2

Y(C、D)(%)=558.97+3.43C+1.41D+1.73CD-3.52C2+0.20D2

由圖5可以看出，在制備植物乳桿菌微膠囊的過(guò)程中,隨壁材配比、壁材添加量、進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料量四個(gè)因素的增加,對(duì)植物乳桿菌微膠囊的包埋率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì),表明在選定的各變量因素范圍內(nèi)可以出現(xiàn)最大包埋率。故利用噴霧干燥法制備植物乳桿菌微膠囊,其包埋率存在最大值。

圖5 兩因素交互作用對(duì)包埋率的影響響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of emulsifier quantity,the core material ratio,casein and the solid concentration on encapsulation yield

2.4 最適工藝參數(shù)確定

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理,得到噴霧干燥法制備微膠囊的最優(yōu)組合為:壁材配比為1∶1.93、壁材添加量為22%、進(jìn)風(fēng)溫度為127.40 ℃、進(jìn)料量為35%,包埋率預(yù)測(cè)值為63.15%。為了能在實(shí)際操作過(guò)程中更好的控制條件,調(diào)整實(shí)際條件為:壁材配比為1∶2、壁材添加量為22%、進(jìn)風(fēng)溫度為127 ℃、進(jìn)料量為35%,在此條件下,制得的植物乳桿菌微膠囊的實(shí)際包埋率為62.15%,與模型預(yù)測(cè)值相比,其相對(duì)偏差較小。因此,基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化噴霧干燥法制備植物乳桿菌微膠囊的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到噴霧干燥法制備固安縣玉米秸稈中植物乳桿菌微膠囊的最優(yōu)實(shí)際條件為:壁材配比1∶2、壁材添加量22%、進(jìn)風(fēng)溫度127 ℃、進(jìn)料量35%,最終得到的植物乳桿菌微膠囊包埋率為62.15%。乳清蛋白-明膠復(fù)合壁材包被植物乳桿菌微膠囊化效果較理想,提高了植物乳桿菌的應(yīng)用價(jià)值,對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有指導(dǎo)作用,為青貯飼料添加劑系列產(chǎn)品研發(fā)提供了新思路。

[1]FAO/WHO. Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria[R]. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live LacticAcid Bacteria,2001.

[2]Reid G. Probiotics in the treatment of diarrheal diseases[J]. Current Infectious Disease Reports,2000,2(1):78-83.

[3]Marteau P,Boutron-Ruault M. Nutritional advantages of probiotics and prebiotics[J].British Journal of Nutrition,2002,87(2):153-158.

[4]Gill HS. Probiotics to enhance anti-infective defences in the gastrointestinal tract[J].Best Practice & Research Clinical Gastroenterology,2003,17(5):755-773.

[5]De R. Effects of probiotic bacteria on diarrhea,lipid metabolism,and carcinogenesis:A review of papers published between 1988 and 1998[J].The American Journal of Clinical Nutrition,2000,71(2):405-411.

[6]Rodriguez-Huezo M E,Duran-Lugo R,Prado-Barragan L A,et al. Pre-selection of protective colloids for enhanced viability of bifidobacterium bifidum following spray-drying and storage,and evaluation of aguamiel as thermoprotective prebiotic[J].Food Research International,2007,40(10):1299-1306.

[7]Palacios M C,Haros M,Rosell C M,et al. Selection of phytate-degrading human bifidobacteria and application in whole wheat dough fermentation[J].Food Microbiology,2008,25(1):169-176.

[8]Lee Y K,Salminen S. Handbook of probiotics and prebiotics[J]. Wiley-Interscience,2009.

[9]Gibson GR,Rastall RA. Gastrointestinal infections and the protective role of probiotics and prebiotics[J]. Food Science and Technology Bulletin:Fu,2005,1(2):1-17.

[10]Zhao M,Zhang F,Wang W,et al. Preparation technology of bifidobacterium bifidum freeze-dried powder and microencapsulation and study on its characters[J].Journal of Biotechnology,2008,136(1):514.

[11]呂沛峰,高彥祥,毛立科，等.微膠囊技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用[J].中國(guó)食品添加劑,2017,(12):166-174.

[12]殷佳雅,馮瑛,楊曉萍.酵母微膠囊包埋茶多酚工藝研究[J].食品工業(yè),2017,38(11):117-121.

[13]Sultana K,Godward G,Reynolds N,et al..Encapsulation of probiotic bacteria with alginate-starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt[J]. International Journal of Food Microbiology,2000,62(1-2):47-55.

[14]李良,魏慶梅,杜鵬，等.雙歧桿菌微膠囊技術(shù)及應(yīng)用[J].中國(guó)乳品工業(yè),2006,34(5):39-42.

[15]吳隆坤,肖志剛.噴霧干燥法制備微膠囊化大豆胚芽油粉末油脂[J].食品工業(yè)科技,2017(24):159-164,171.

[16]李寧,田洪濤,吳蕊,等.雙歧桿菌微膠囊噴霧干燥工藝的影響因素研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(8):89-91.

[17]曾潔,李永幸,洪清林，等.卡拉膠酶固體酶制劑的噴霧干燥制備工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2017(24):152-158.

[18]韓冬冬,于才淵,周禹君.石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的微膠囊包被研究[J].干燥技術(shù)與設(shè)備,2007,5(2):93-96.

[19]Devi N,Sarmah M,Khatun B,et al. Encapsulation of active ingredients in polysaccharide-protein complex coacervates[J]. Advances in Colloid and Interface Science,2017,239:136-145.

[20]王睦.聚合乳清蛋白基微膠囊技術(shù)及其在功能性食品中的應(yīng)用[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2017.

[21]曹祥薇,胡蓓,侯寧,等.明膠/麥芽糊精復(fù)合壁材制備香精微膠囊[J].黑龍江大學(xué)工程學(xué)報(bào),2017,8(2):47-50.

[22]張慧杰.飼草青貯微生物菌群動(dòng)態(tài)變化與乳酸菌的鑒定篩選[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011.

[23]朱曉麗,劉力娜,張志國(guó)，等.乳清蛋白/阿拉伯膠復(fù)凝聚法制備載乙酸油酯微膠囊及其表征[J].高分子學(xué)報(bào),2009(10):1062-1069.

[24]黃序,戚薇,王建玲，等.腸溶性雙歧桿菌微膠囊的初步研究[J].藥物生物技術(shù),2002,9(2):105-109.

[25]李寧.雙歧桿菌微膠囊制備工藝及功能特性的研究[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.