楚電峰，徐慧琳，薄智勇，劉秋云，李 娜，劉相娥

(青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114)

新城疫(Neweastle disease，ND)是由新城疫病毒(Neweastle disease virus，NDV)引起的一種接觸性、高致死率的傳染病，是養(yǎng)禽生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的疫病之一[1]。近年來，國內(nèi)接種NDV活疫苗和滅活苗的雞群中，仍時有新城疫的發(fā)生，其重要的原因可能是免疫雞群中存在免疫失敗的現(xiàn)象[2]。隨著免疫壓力的不斷增大、變異株的不斷出現(xiàn)，原有的疫苗免疫效果發(fā)揮不了明顯的作用[3]。NDV經(jīng)歷了大量的遺傳進(jìn)化，發(fā)展成幾個不同的基因型(Ⅰ～Ⅸ)，不同類型的NDV其毒力相差很大，在這些基因型中，基因Ⅶ型被認(rèn)為是在20世紀(jì)90年代引起西歐[4]、非洲南部、歐洲南部[5]和東亞嚴(yán)重疫情的罪魁禍?zhǔn)祝壳?，基因Ⅶ型NDV仍然在中國盛行[6]。我國目前常用的傳統(tǒng)疫苗毒株La Sota、Clone 30、V4等均屬于經(jīng)典型基因Ⅱ型和Ⅰ型毒株，而造成目前新城疫廣泛流行的野毒株多屬于基因Ⅵ型和Ⅶ型[6]。免疫效果不僅與疫苗質(zhì)量、免疫程序有關(guān)，而且與新城疫毒株的變異、不同基因型毒株的出現(xiàn)有密切關(guān)系[7]。因此，對新城疫不同基因型毒株進(jìn)行免疫原性研究，將對新城疫疫苗的發(fā)展和疾病防控發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 基因Ⅶ型A-Ⅶ株油乳劑滅活疫苗，制苗前抗原HA效價為1∶1 024；基因Ⅱ型La Sota株油乳劑滅活疫苗，制苗前抗原HA效價為1∶1 024，均來自青島易邦生物工程有限公司。

1.1.2 檢測抗原 基因Ⅶ型檢測抗原，HA效價為1∶1 024，來自青島易邦生物工程有限公司；基因Ⅱ型La Sota株檢測抗原，HA效價為1∶1 024，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 攻毒毒株 基因Ⅶ型強(qiáng)毒YND株，效價為108.17ELD50/0.1 mL，來自青島易邦生物工程有限公司；新城疫標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株，效價為108.17ELD50/0.1 mL，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.4 試驗(yàn)用動物和雞胚 21日齡SPF雞，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；非免疫雞胚，來自青島易邦生物工程有限公司；SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫接種 21日齡SPF雞30只隨機(jī)分為A、B、C 3組，試驗(yàn)組A、B和對照組C各10只，A、B兩組分別用基因Ⅶ型A-Ⅶ株和基因Ⅱ型La Sota株油乳劑滅活疫苗頸部皮下免疫接種21日齡SPF雞各10只，20 μL/只，健康對照組不免疫。試驗(yàn)組免疫接種后7、14、21、28 d分別采血，對照組21 d和28 d分別采血，分離血清，按照2015版《中華人民共和國獸藥典》附錄3404，測定血清中新城疫的HI抗體。

1.2.2 攻毒 免疫后21 d，2組試驗(yàn)雞及對照雞均隨機(jī)均分，根據(jù)2015版《中華人民共和國獸藥典》雞新城疫滅活疫苗攻毒方法，分別肌肉注射基因Ⅶ型強(qiáng)毒YND株和標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株0.5 mL(含105.0ELD50/只)，攻毒后每天觀察試驗(yàn)雞發(fā)病死亡情況，連續(xù)觀察14 d。

1.2.3 病毒分離 攻毒后第3、5、7天分別采喉頭和泄殖腔拭子，于裝有1 mL含雙抗生理鹽水的1.5 mL離心管中(雙抗單位為2 000 UI/mL)，凍融3次，振蕩后離心取上清，經(jīng)尿囊腔接種10.5日齡非免疫雞胚，5枚/樣品，置37℃，濕度60%孵化箱中，培養(yǎng)72 h，棄去24 h內(nèi)的死胚，收獲尿囊液進(jìn)行HA檢測，在每個樣品接種的5枚雞胚中，有1枚尿囊液HA為陽性(≥1∶128)判為病毒分離呈陽性；對病毒分離陰性的樣品，應(yīng)盲傳1代后再進(jìn)行判定。

1.2.4 病毒載量測定 取病毒分離呈陽性的胚液做病毒滴度測定(EID50)。對收獲的免疫組尿囊液做10-1～10-3稀釋；對照組做10-3～10-6稀釋，經(jīng)尿囊腔接種10.5日齡 SPF雞胚，5枚/稀釋度，置37℃，濕度60%孵化箱中，孵育120 h，棄去24 h內(nèi)死胚，收獲尿囊液按照2015版《中華人民共和國獸藥典》附錄3402，測定EID50。

2 結(jié)果

2.1 免疫后抗體水平檢測結(jié)果

在免疫接種后第7、14、21、28天后分別采血，分別以基因Ⅶ型A-Ⅶ株和基因Ⅱ型La Sota株為抗原檢測兩種疫苗免疫后四周內(nèi)血清抗體消長規(guī)律，結(jié)果如表1所示，隨著時間的延長，試驗(yàn)A、B兩組抗體水平均呈遞增趨勢，且未免疫對照組未檢測到明顯抗體水平，說明兩種疫苗均能引起明顯的免疫反應(yīng)。免疫后7 d兩組抗體水平出現(xiàn)差異，14 d后基因Ⅶ型A-Ⅶ株免疫組以A-Ⅶ抗原檢測得抗體水平明顯高于基因Ⅱ型La Sota株免疫組以La Sota抗原檢測的抗體水平，說明基因Ⅶ型A-Ⅶ株的免疫原性更好。

表1 免疫后抗體水平檢測 (log2)

2.2 攻毒后免疫保護(hù)結(jié)果

結(jié)果如表2所示，免疫21 d后攻標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株和基因Ⅶ型強(qiáng)毒YND株，2種疫苗針對2株強(qiáng)毒均能提供100%的臨床保護(hù)，2組免疫組雞精神、食欲均正常。對照組雞攻毒后2 d，表現(xiàn)出精神不振、排黃綠色糞便，3 d～5 d均死亡。

表2 攻毒后臨床觀察保護(hù)效果

2.3 攻毒后病毒分離結(jié)果

分別用基因Ⅶ型強(qiáng)毒YND株和標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株攻毒，采棉拭子測定排毒情況如表3所示， 對F48E9的攻擊，在喉頭排毒方面，基因Ⅶ型A-Ⅶ株免疫雞第3天有1只雞檢測到排毒，La Sota株疫苗免疫雞第3天3只雞檢測到排毒；泄殖腔排毒方面，基因Ⅶ型A-Ⅶ株和基因Ⅱ型La Sota株疫苗免疫雞均未檢測到排毒。對于基因Ⅶ型強(qiáng)毒YND株的攻擊，2種疫苗則呈現(xiàn)出了明顯的差異，基因Ⅶ型A-Ⅶ株免疫雞喉頭及泄殖腔均未檢測到排毒；La Sota株疫苗免疫雞，在喉頭排毒方面，第3天和第5天均有5只雞均檢測到排毒，在泄殖腔排毒方面，第5天有3只雞排毒。對照組未免疫雞第4至5天全部死亡。結(jié)果表明，在標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株和基因Ⅶ型強(qiáng)毒YND株攻擊下，基因Ⅶ型A-Ⅶ株疫苗抑制病毒復(fù)制和排毒的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)基因Ⅱ型La Sota株疫苗。

2.4 病毒載量測定

通過棉拭子測定排毒情況，對采集的陽性樣品進(jìn)行EID50的測定，結(jié)果如表4所示，免疫基因Ⅶ型A-Ⅶ株疫苗的雞，攻擊標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株，喉頭排毒測得病毒載量EID50為101.17/0.1 mL，攻擊基因Ⅶ型強(qiáng)毒YND株作，未檢測到排毒感染，而免疫La Sota株疫苗的雞，以F48E9攻毒，檢測喉頭排毒載量EID50為101.31/0.1 mL。而以YND攻毒，檢測喉頭第3天排毒載量EID50為101.45/0.1 mL，第5天為101.03/0.1 mL，檢測泄殖腔第3天的排毒載量EID50為101.42/0.1 mL，上述結(jié)果說明基因Ⅶ型A-Ⅶ株滅活疫苗比基因Ⅱ型La Sota株滅活疫苗更有效的減少了病毒在雞體內(nèi)的復(fù)制、繁殖與排毒。

表3 攻毒后病毒分離結(jié)果

表4 兩種疫苗免疫攻毒后病毒載量測定

3 討論

新城疫是禽副黏病毒引起的主要傳染病之一，目前疫苗免疫接種是防控新城疫的最主要措施，在我國，雖廣泛使用新城疫疫苗進(jìn)行免疫，但新城疫疾病仍不斷發(fā)生，主要由于NDV不同基因型毒株間的毒力和抗原性有一定的差異，所以采用與最新分離毒株同源性高的毒株作為疫苗株，加強(qiáng)對雞群新城疫的預(yù)防免疫，可能能有效的控制野毒株在雞群中的傳播[8]。劉華雷等[9]通過對不同地區(qū)篩選的具有代表性的16株NDV對其F基因重要的功能區(qū)片段進(jìn)行克隆及序列分析發(fā)現(xiàn)，16株分離株中13株為基因Ⅶ型。流行病學(xué)數(shù)據(jù)也充分證明當(dāng)前Ⅶ亞型在我國流行強(qiáng)毒株中占有絕對優(yōu)勢[1]。本文通過比較基因Ⅶ型A-Ⅶ株制備的疫苗與傳統(tǒng)的基因Ⅱ型La Sota 株所制備的滅活疫苗對免疫雞的抗體效價影響發(fā)現(xiàn)，基因Ⅶ型A-Ⅶ株所產(chǎn)生的HI抗體效價明顯高于La Sota株滅活疫苗組。通過攻毒試驗(yàn)結(jié)果分析，無論對于F48E9的攻擊還是YND的攻擊，基因Ⅶ型A-Ⅶ株疫苗免疫雞和基因Ⅱ型La Sota株滅活苗免疫雞，均能提供100%的臨床保護(hù)。但基因Ⅶ型A-Ⅶ株滅活苗比基因Ⅱ型La Sota株滅活苗能夠更好的抑制兩種毒株病毒在體內(nèi)的復(fù)制和排毒。目前，廣泛應(yīng)用的新城疫基因Ⅱ型La Sota株滅活苗對流行的基因Ⅶ型病毒仍能提供良好的免疫保護(hù)[10]，但僅僅是從保護(hù)雞群不發(fā)病的角度來評價，這種評價方式可能并不全面，因?yàn)長a Sota株滅活苗免疫后不能完全抑制基因Ⅶ型病毒在體內(nèi)的復(fù)制和排毒，也可能在雞群抵抗力低下時引發(fā)感染[11]。新城疫傳統(tǒng)疫苗毒株與流行毒株之間存在一定的毒力和抗原方面的差異，我國新城疫的發(fā)生和流行除了關(guān)注經(jīng)典毒株致病外，還應(yīng)重視NDV基因Ⅶ型毒株在自然界的廣泛存在，才能更好地控制疫病的發(fā)生，保障家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

參考文獻(xiàn):

[1] Munir M,Abbas M,Khan M T,et al.Genomic and biological characterization of a velogenic Newcastle disease virus isolated from a healthy backyard poultry flock in 2010[J].Virol J,2012,9(1):1-11.

[2] 何雷堂，薛云德．一株新城疫基因Ⅶ型病毒株的分子生物學(xué)鑒定[J]．河南畜牧獸醫(yī):綜合版，2000(12)：6-7．

[3] 王永坤，嚴(yán)維?。u副粘病毒病的病毒特性和基因型研究及疫病防制[J]．揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2000，3(2)：25-29．

[4] Lomniczi B,Wehmann E,Herczeg J,et al.Newcastle disease outbreaks in recent years in western Europe were caused by an old (VI) and a novel genotype (Ⅶ) [J].Arch Virol,1998,143:49-64.

[5] Herczeg J,Wehmann E,Bragg R R,et al.Two novel genetic groups (Ⅶb and Ⅷ) responsible for recent Newcastle disease outbreaks in Southern Africa,one (Ⅶb) of which reached Southern Europe[J].Arch Virol,1999,144:2087-2099.

[6] 趙 雯,劉瑞菊,孫軍峰,等.表達(dá)基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白重組LaSota疫苗株的構(gòu)建[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2017,39(5):407-411.

[7] 于 淼，王洪利，姜 平．雞新城疫病毒基因Ⅶ型和LaSota株滅活疫苗免疫保護(hù)效力觀察[J]．畜牧與獸醫(yī)，2014，46(2)：56-58．

[8] Miller P J,King D J,Afonso C L,et al.Antigenic differences among Newcastle disease virus strains of different genotypes used in vaccine formulation affect viral shedding after a virulent challenge[J].Vaccine,2007，25(41):7238-7246.

[9] 劉華雷，王永坤，嚴(yán)維巍，等．我國部分地區(qū)新城疫病毒的流行現(xiàn)狀分析[J]．中國獸醫(yī)學(xué)報，2003，23(3)：218-221．

[10] 王友令，懷 英，李 莉，等．新城疫La Sota疫苗對不同基因型流行株的免疫保護(hù)[J]．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2009，21(5)：446-449．

[11] Roohani K,Tan S W,Yeap S K,et al.Characterisation of genotype Ⅶ Newcastle disease virus (NDV) isolated from NDV vaccinated chickens,and the efficacy of La Sota and recombinant genotype Ⅶ vaccines against challenge with velogenic NDV[J].J Vet Sci,2015,16(4):447-457.