杜 琳，王麗芳，馮小慧，張三粉，宋 潔，姚一萍，史 培，申 捷

(1.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院，內蒙古呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區(qū)疫病預防控制中心，內蒙古呼和浩特 010010)

全球范圍內，奶牛乳房炎是影響奶業(yè)發(fā)展的重要因素之一。每年因乳房炎造成的經濟損失巨大，每年全球因奶牛乳房炎損失將近350億美元[1]，其中美國損失20億美元[2]，英國損失3億英鎊[3]，荷蘭每頭牛因患乳房炎損失114歐元[4]，我國每年損失150億元～450億元[5]。目前治療奶牛乳房炎主要依賴于抗生素的使用，從而導致藥物殘留等問題[6]，威脅著我國的食品安全。奶牛乳房炎及其致病菌對奶牛的高感染率和強耐藥性，已經嚴重制約奶業(yè)的健康發(fā)展，而且由于其流行范圍廣、感染部位多、多重耐藥性等也給臨床防治帶來巨大的困難[7]。我國奶業(yè)在奶牛乳房炎病原菌的防控和獸藥殘留方面面臨的問題尤為嚴峻。因此，為摸清我國奶牛被病原菌感染情況和耐藥情況，急需開展奶牛乳房炎病原菌的耐藥性風險評估，其研究成果不僅將為獸醫(yī)臨床用藥提供可靠的理論依據，防止濫用抗生素，而且將為控制細菌耐藥性的擴散提供幫助。同時通過開展不同地域奶牛感染病原菌情況的了解，掌握各地區(qū)不同病原菌的感染率，將為國家政府部門有目的、有計劃、有步驟的開展病原菌防控和獸藥殘留監(jiān)管提供指導意見[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶樣 對我國生鮮乳主產省區(qū)黑龍江、內蒙、山東、河北及上海5個省(市、自治區(qū))共247批次患乳房炎(包括臨床乳房炎與隱性乳房炎)病牛乳樣。每個省(市、自治區(qū))，選擇4種規(guī)模的牧場奶牛存欄：①500頭以下；②500頭～ 1 000頭；③1 000頭～3 000頭；④大于3 000頭，每個類型10個～15個，其中內蒙古、黑龍江、上海、河北各50份樣本，山東47份。采樣時棄去前3把乳，無菌取乳樣50 mL左右，4℃保存待檢。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 綿羊脫纖血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司產品；氟苯尼考、氨曲南、利福平、氧氟沙星、復方新諾明、氯霉素、萬古霉素、頭孢西丁、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、克林霉素、苯唑西林、妥布霉素、利奈唑胺、美羅培南、奧格門汀、紅霉素、氨芐西林、頭孢噻呋、阿奇霉素、哌拉西林，由上海星佰生物技術有限公司定制成革蘭陽性菌藥敏板、革蘭陰性菌藥敏板。藥敏試驗藥物的選擇參考美國臨床與實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和農業(yè)部奶產品質量風險評估實驗室(北京)提出的藥敏試驗方案制定的藥敏試驗標準；2×EasyTaq?PCR Super Mix、細菌基因組DNA小量純化試劑盒，北京全式金生物技術有限公司產品；DNA標準DL 2 000、Agarose，寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 取1 mL無菌采集的牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀，用滅菌棉拭子分別于綿羊脫纖血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB 培養(yǎng)基)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)16 h后觀察菌落形態(tài)。挑取疑似菌落染色鏡檢、進行純培養(yǎng)。并對分離獲得的流行菌株編號，對其分離時間、分離地點等信息進行記錄歸檔。

1.2.2 分子生物學鑒定

1.2.2.1 細菌基因組DNA的小量提取 參照全式金提取細菌基因組DNA小量純化試劑盒說明書進行。

1.2.2.2 16 S rDNA基因的PCR擴增 以提取出的細菌基因組DNA為模板，根據GenBank上的DNA序列設計[9]通用引物，其引物序列為：Bacterial 16s-F：ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT，Bacterial 16s-R：CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT。反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，75℃ 90 s，反應進行30個循環(huán)；72℃ 10 min。預期目的條帶大小為1 500 bp。

1.2.2.3 PCR產物的基因測序及序列分析 將PCR產物純化后連接pEasy-T1載體上，轉化至Trans-T1感受態(tài)細胞中，選取陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。所測基因序列與GenBank中已有序列進行Blast同源性比對。

1.2.3 藥敏試驗 對分離出的主要病原菌進行藥敏試驗，按照CLSI推薦的肉湯稀釋法進行，用大腸埃希菌標準菌株(ATCC25922)作為質控菌，根據CLSI(2016)的標準判斷其耐藥性[10]。

2 結果

2.1 細菌的形態(tài)學鑒定結果

對分離到的菌株進行形態(tài)學鑒定，金黃色葡萄球菌在高鹽甘露醇培養(yǎng)基上顯黃色，其外圍有一黃色的暈環(huán)。鏈球菌在50 mL/L綿羊脫纖血瓊脂平板上呈淡灰白色、隆起、閃光的小菌落。大腸埃希菌在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落中心呈紫黑色，有金屬光澤?？死撞暇邴溈祫P培養(yǎng)基上呈紅色，用接種環(huán)挑取，有明顯的拉絲現象。

革蘭染色并在油鏡下進行鏡檢，金黃色葡萄球菌呈現革蘭陽性的球菌，排列成葡萄串狀。鏈球菌呈現革蘭陽性球菌，鏈狀排列。大腸埃希菌呈現革蘭陰性直桿菌，兩端鈍圓。克雷伯菌呈現較粗短的革蘭陰性桿菌。

2.2 分子生物學鑒定結果

用通用引物對分離株進行細菌16 S rDNA基因擴增，所得產物通過瓊脂糖凝膠電泳，均擴增出1 500 bp大小的片段。在NCBI上進行Blast比對。其中大腸埃希菌65株，占 37.14%；金黃色葡萄球菌30株，占17.14%；糞腸球菌21株，占12.00%；克雷伯菌18株，占10.29%；鏈球菌13株，占7.43%；檸檬酸桿菌12株，占6.86%；腐生葡萄球菌5株，占2.86%；變形桿菌4株，占2.29%；黏質沙雷菌3株，占1.71%；表皮葡萄球菌2株，占1.14%；產色葡萄球菌1株，占0.57%；鄉(xiāng)間布丘菌1株，占0.57%。每個省(市、自治區(qū))的細菌分離情況見表1。

2.3 藥敏試驗結果

2017年上半年共采集黑龍江省、內蒙古自治區(qū)、河北省、上海市及山東省5個省(市、自治區(qū))247批次患病乳房炎奶牛乳樣，分離出革蘭陽性菌72株。對分離的革蘭陽性菌進行藥敏性試驗，以確定其耐藥情況。

本年度調研中用于革蘭陽性菌耐藥性試驗的20種藥物來自11大類藥物，其中β內酰胺類7種、氨基糖苷類2種，四環(huán)素類1種，磺胺類1種，喹諾酮類2種，林可酰胺類1種，大環(huán)內酯類2種，氯霉素類1種，糖肽類1種，噁唑烷酮類1種，安莎霉素類1種。

革蘭陽性菌的藥敏試驗結果見表2。本次試驗分離到的革蘭陽性菌大部分具有不同程度的耐藥性，并且大多數為多重耐藥菌，其中耐單一藥物的6株，耐藥種類數最多的只有1株，能夠耐受11種藥物。單種藥物藥敏結果表明，所分離得到革蘭陽性菌對氨曲南的耐藥率最高，達到了100%，其次為青霉素(80.56%)、氟苯尼考(56.94%)、紅霉素(52.78%)、氧氟沙星(43.06%)、頭孢西丁(43.06%)、美羅培南(43.06%)、克林霉素(43.06%)和妥布霉素(40.28%)耐藥率均高于40%。耐藥率低于10%的為萬古霉素(全部敏感)、苯唑西林(全部敏感)、利奈唑胺(全部敏感)、奧格門汀(全部敏感)、復方新諾明(2.78%)、氯霉素(2.78%)、環(huán)丙沙星(6.94%)和氨芐西林(9.72%)。

表1 各個地區(qū)的細菌分布情況

表2 革蘭陽性菌的藥敏試驗結果

2017年上半年共采集黑龍江省、內蒙古自治區(qū)、河北省、北京市、上海市、山東省及四川省等5個省市自治區(qū)247批次患病乳房炎奶牛乳樣，分離出革蘭陰性菌103株。對分離的革蘭陰性菌進行藥敏性試驗，以確定其耐藥情況。

本年度調研中用于耐藥性試驗的15種藥物來自7大類藥物，其中β內酰胺類7種，氨基糖苷類1種，四環(huán)素類1種，磺胺類1種，喹諾酮類2種，氯霉素類2種，大環(huán)內酯類1種。

革蘭陰性菌的藥敏試驗結果見表3。本次試驗分離到的革蘭陰性菌大部分具有不同程度的耐藥性，并且大多數為多重耐藥菌，其中，耐單一藥物的8株(7.77%)。耐藥種類數最多的只有2株，能夠耐受10種藥物。單種藥物藥敏結果表明，所分離得到革蘭陰性菌對氨芐西林的耐藥性最高，達到了83.50%，其次為氟苯尼考(44.66%)、四環(huán)素(43.69%)耐藥率均高于40%。耐藥率低于10%的有美羅培南(全部敏感)、頭孢西丁(5.83%)和氨曲南(9.71%)。

3 討論

本試驗從黑龍江、內蒙、山東、河北和上海等地區(qū)共計247份乳房炎乳樣中分離到到細菌 175 株，通過形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定。確定最終分離到大腸埃希菌65株，金黃色葡萄球菌30株，糞腸球菌21株，克雷伯菌18株，鏈球菌13株，檸檬酸桿菌12株，腐生葡萄球菌5株，變形桿菌4株，黏質沙雷菌3株，表皮葡萄球菌2株，產色葡萄球菌1株，鄉(xiāng)間布丘菌1株。這說明乳房炎不僅僅是由單一細菌引起的，而是由多種細菌共同感染導致[11]。其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、克雷伯菌為奶牛乳房炎的主要病原菌。

從每個省(市、自治區(qū))的細菌分離情況來看，細菌分布呈現明顯的區(qū)域性[12]。其中內蒙古地區(qū)大腸埃希菌的分離率明顯高于其他4個地區(qū)，大腸埃希菌是引起乳房炎最重要的環(huán)境致病菌，大腸埃希菌廣泛存在于牛群的環(huán)境之中。牛舍中的糞便和牛床墊料都存在環(huán)境性病原菌，在擠奶、擠奶間歇期及干奶期時乳腺組織均可被感染，由于奶牛不斷地與環(huán)境中的病原菌接觸，加之在內蒙古地區(qū)采樣前不久，剛剛下過雨，這可能導致了奶牛的牛床和運動場較為泥濘，加重了大腸埃希菌等環(huán)境性致病菌的感染[13]。黑龍江地區(qū)的金黃色葡萄球菌分離率明顯高于其他4個地區(qū)，金黃色葡萄球菌則是引起奶牛乳房炎最重要的傳染性病原菌，金黃色葡萄球菌對乳腺組織有高度的親和力，主要損害乳房上皮細胞和腺泡的功能，導致牛奶產量和質量下降[14]。河北地區(qū)的病原菌則以糞腸球菌為主，糞腸球菌是哺乳動物的正常菌群的一部分，當奶牛乳頭閉鎖不全或受損時，糞腸球菌機會性的侵入乳房，引起感染。

表3 革蘭陰性菌的藥敏試驗結果

本研究通過藥物敏感性試驗進行分析，結果表明乳房炎病原菌對臨床上使用的抗菌藥物產生了不同程度的耐藥性，尤其革蘭陽性菌對氨曲南、青霉素、氟苯尼考、紅霉素、氧氟沙星、頭孢西丁、美羅培南、克林霉素及妥布霉素耐藥。革蘭陰性菌對氨芐西林、氟苯尼考及四環(huán)素耐藥。因此，在使用獸藥時應根據各地區(qū)流行菌株的耐藥特點，選擇敏感性高的藥物。

目前，細菌的耐藥性已得到了國內和國際上的廣泛關注[15-16]，我國為了加強獸用抗菌藥物管理，保障動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，我國農業(yè)部獸醫(yī)局在2017年組織起草了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃(2017年-2020年)》，對生鮮乳中主要病原微生物的分離鑒定以及耐藥性的檢測，為獸藥殘留監(jiān)控、動物源性細菌耐藥監(jiān)測、監(jiān)管體系建設與完善提供專業(yè)指導，為牧場和奶牛的飼養(yǎng)管理提供更切實有效的用藥方案，切實保障養(yǎng)殖業(yè)生產安全、動物性食品安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)環(huán)境安全。

參考文獻：

[1] Mungube E,Tenhagen B,Regassa F,et al.Reduced milk production in udder quarters with subclinical mastitis and associated economic losses in crossbred dairy cows in Ethiopia[J].Trop Anim Health Pro,2005,37(6): 503-512.

[2] Kayitsinga J,Schewe R L,Contreras G A,et al.Antimicrobial treatment of clinical mastitis in the eastern United States: The influence of dairy farmers' mastitis management and treatment behavior and attitudes.[J].J Dairy Sci,2016,100(2):1388-1407.

[3] Down P M,Bradley A J,Breen J E,et al.A Bayesian micro-simulation to evaluate the cost-effectiveness of interventions for mastitis control during the dry period in UK dairy herd:[J].Prev Vet Med,2016,133:64-72.

[4] Harel D A.IDF : Les chance de guerre s’accroissent sur les fronts libanais et syrien[J].J Dairy Sci,2015,98(4):2369-2380.

[5] 曹立亭.乳酸鏈球菌素治療奶牛臨床型乳房炎的研究[D].浙江杭州：浙江大學,2009.

[6] Barkema H W,Schukken Y H,Lam T J G M,et al.Incidence of clinical mastitis in dairy herds grouped in three categories by bulk milk somatic cell counts[J].Dairy Sci,1998,81:411-419.

[7] 李新圃,李宏勝,羅金印,等.奶牛乳房炎致病菌的分離鑒定及耐藥性研究[J].動物醫(yī)學進展,2015,36(11):36-39.

[8] 蘇 洋,蒲萬霞,陳智華,等.牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測[J].中國農業(yè)科學,2012,45(17):3602-3607.

[9] Weisburg W G,Barns S M,Pelletier D A,et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol,1991,173(2):697.

[10] Jorgensen J H.Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria; approved guideline[M].United States:Clinical and Laboratory Standards Institute,2015.

[11] 韓 笑,刀筱芳,張煥容,等.奶牛隱性乳房炎主要病原菌分離鑒定及耐藥性分析[J].動物醫(yī)學進展,2015,36(7):131-134.

[12] 郝景鋒,李靜姬,張宇航,等.吉林省奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學進展,2016,37(12):126-129.

[13] 趙建榮.奶牛環(huán)境性乳腺炎滅活疫苗的研制及效果評價[D].內蒙古呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學,2009.

[14] 唐吉思,吳金花,布日額,等.牛乳腺炎金黃色葡萄球菌腸毒素A基因的克隆及序列分析[J].中國動物傳染病學報,2011,19(3):38-42.

[15] Tian J,Zhang J,Yang J,et al.Conjugated polymers act synergistically with antibiotics to combat bacterial drug resistance[J].Acs Appl Mater Inter,2017,9(22):18512-18520.

[16] 張純萍,宋 立,吳辰斌,等.我國動物源細菌耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)簡介[J].中國動物檢疫,2017,34(3):34-38.