孫妍 董學(xué)旺 魏俊利 薛淑霞

摘 要 為建立一種快速檢測(cè)蝦肝腸胞蟲（EHP）的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP），根據(jù)GenBank中登錄的EHP-SSU基因序列設(shè)計(jì)了6條LAMP特異性引物，經(jīng)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了EHP-LAMP檢測(cè)方法。該方法的檢出限為3.71個(gè)質(zhì)?？截?μL；與對(duì)蝦其他常見(jiàn)病毒病的病原（WSSV、IHHNV、CMNV）均無(wú)交叉反應(yīng)。使用LAMP方法和普通PCR方法對(duì)30份具有典型EHP感染癥狀的對(duì)蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：LAMP和PCR方法的陽(yáng)性檢出率均為100%。表明建立的EHP-LAMP方法具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，適用于生產(chǎn)中對(duì)蝦肝腸胞蟲的快速早期診斷，為EHP的防治提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 對(duì)蝦；肝腸胞蟲；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S945.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.09.058

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器設(shè)備

采自天津市東麗區(qū)華明街胡張莊村的南美白對(duì)蝦樣品，具有典型的EHP感染癥狀，經(jīng)PCR檢測(cè)并測(cè)序后確認(rèn)為EHP感染，由本實(shí)驗(yàn)室保存；經(jīng)檢測(cè)未感染EHP的對(duì)蝦基因組、僅感染對(duì)蝦白斑病毒（WSSV）的對(duì)蝦基因組、僅感染對(duì)蝦皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）的對(duì)蝦基因組、僅感染偷死野田村病毒（CMNV）的對(duì)蝦RNA均由本單位病原檢測(cè)室提供；海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（天根生物）；10 mM dNTP、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自大連寶生物（TakaRa）；Bst DNA聚合酶（NEB）、鈣黃綠素染料（北京藍(lán)譜）、甜菜堿（Sigma）。PCR儀（ABI）、凝膠成像系統(tǒng)（Biometra）、金屬浴（天根生物）、離心機(jī)（Sigma）、電泳儀（北京六一）[1]。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank發(fā)布的EHP基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)資料，選取EHP-SSU（登錄號(hào)：FJ496356.1）為靶基因，按照LAMP引物設(shè)計(jì)原則，使用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 5 （http：//primerexplorer.jp/e）設(shè)計(jì)6條引物，分別為外引物F3/B3，內(nèi)引物FIP/BIP和環(huán)引物L(fēng)F/LB，引物由上海生工合成[2]。

1.2.2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

按照海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取感染EHP對(duì)蝦的基因組DNA，作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增反應(yīng)的模板。EHP-LAMP的基礎(chǔ)反應(yīng)體系（25μL）：2.5μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，3.5μL 10 mM dNTP，1.5μL 100 mM MgSO4，0.4μL 100 μM FIP，0.4 μL 100 μM BIP，0.2μL 100 μM LF，0.2μL 100μM LB，0.05μL 100 μM F3，0.05μL 100μM B3，8 U Bst DNA聚合酶，1μL鈣黃綠素染料，3μL 5 M甜菜堿，滅菌水適量，2μL模板。基礎(chǔ)反應(yīng)條件為63 ℃ 60 min，80 ℃ 10 min。為了得到最佳擴(kuò)增效果，在基礎(chǔ)反應(yīng)體系上對(duì)其可能影響較大的試劑，如甜菜堿、dNTP、MgSO4、Bst DNA聚合酶等的用量以及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的靈敏度試驗(yàn)

將用于EHP-LAMP引物設(shè)計(jì)的SSU基因序列與pUC57載體連接，構(gòu)建SSU-pUC57質(zhì)粒，質(zhì)粒構(gòu)建工作由上海生工完成。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取SSU-pUC57質(zhì)粒，利用核酸檢測(cè)儀測(cè)定所提取質(zhì)粒的初始濃度，根據(jù)公式：質(zhì)?？截悢?shù)/μL=質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量×阿佛加德羅常數(shù)，計(jì)算出SSU-pUC57質(zhì)?？截悢?shù)為3.71×109，用滅菌水按10倍遞進(jìn)稀釋法將質(zhì)粒稀釋至3.71個(gè)質(zhì)?？截?μL，取2μL各濃度稀釋液分別進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增（以F3/B3為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為191 bp），比較兩種方法的最低檢測(cè)量。

1.2.4 LAMP反應(yīng)體系的特異性試驗(yàn)

將天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心病原檢測(cè)室提供的僅感染W(wǎng)SSV的對(duì)蝦基因組、僅感染IHHNV的對(duì)蝦基因組、僅感染CMNV的對(duì)蝦RNA（反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板）以及感染EHP的對(duì)蝦基因組，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照（SSU-pUC57質(zhì)粒），按照上述建立的LAMP方法進(jìn)行EHP-LAMP檢測(cè)體系的特異性分析。

1.2.5 臨床樣品的檢測(cè)

同時(shí)利用本研究建立的EHP-LAMP檢測(cè)技術(shù)和PCR方法，分別對(duì)挑選30尾具有典型感染EHP癥狀的對(duì)蝦進(jìn)行檢測(cè)，并將這兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 EHP-LAMP的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，發(fā)現(xiàn)甜菜堿、MgSO4和dNTP的加入量對(duì)EHP-LAMP反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率影響較大。最終確定EHP-LAMP的最佳反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，2.5 μL 10 mM dNTP，2 μL 100 mM MgSO4，0.4 μL 100 μM FIP，0.4 μL 100 μM BIP，

0.2 μL 100 μM LF，0.2 μL 100 μM LB，0.05 μL 100μM F3，0.05 μL 100μM B3，8 U Bst DNA聚合酶，1 μL鈣黃綠素染料，1 μL 5M甜菜堿，2 μL模板滅菌水定容總體積至25 μL。反應(yīng)條件為63 ℃ 40 min，80 ℃ 5 min。

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

利用優(yōu)化條件后的EHP-LAMP和PCR檢測(cè)方法對(duì)不同稀釋倍數(shù)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示：LAMP檢測(cè)方法的檢出限為3.71個(gè)質(zhì)?？截?μL，PCR檢測(cè)方法的檢出限為371個(gè)質(zhì)粒拷貝/μL，LAMP檢測(cè)方法的靈敏度高于PCR。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用優(yōu)化條件后的EHP-LAMP反應(yīng)體系對(duì)含有WSSV、IHHNV、CMNV和EHP的對(duì)蝦基因組及SSU-pUC57質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：只有含有EHP對(duì)蝦基因組和SSU-pUC57質(zhì)粒出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，而含有WSSV、IHHNV和CMNV的對(duì)蝦基因組以及陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明建立的EHP-LAMP方法與對(duì)蝦其他常見(jiàn)病毒病的病原均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

利用優(yōu)化條件后的EHP-LAMP和PCR方法分別對(duì)30份具有典型EHP感染癥狀的對(duì)蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照。結(jié)果顯示：EHP-LAMP和PCR方法的陽(yáng)性檢出率均為100%，其中5份樣品PCR檢測(cè)條帶較弱，為弱陽(yáng)性。

3 討論

EHP屬于微孢子蟲，其個(gè)體小于細(xì)胞，很難通過(guò)顯微鏡觀察到，重癥感染的對(duì)蝦肝胰腺在常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色下也很難觀察到特征性病理變化，而通過(guò)原位雜交則能顯示對(duì)蝦感染EHP后其肝胰腺小管上皮細(xì)胞中存在明顯雜交信號(hào)，因此分子檢測(cè)是微孢子蟲的有效檢測(cè)手段。目前，相關(guān)EHP檢測(cè)方法主要包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、普通PCR法、巢式PCR法等，而這些檢測(cè)手段需要專業(yè)的技術(shù)操作人員和在專業(yè)的分子實(shí)驗(yàn)室中才能完成。我國(guó)2013—2015年的養(yǎng)殖對(duì)蝦EHP攜帶情況調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，EHP具有較高的陽(yáng)性檢出率，已成為導(dǎo)致對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的主要病原。EHP主要侵染蝦苗和幼蝦，且在感染早期沒(méi)有明顯癥狀，在購(gòu)買苗種的時(shí)候很難引起人們的注意，嚴(yán)重影響了蝦農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收益。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、適用于實(shí)際生產(chǎn)的EHP檢測(cè)方法十分必要?；诖耍鶕?jù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）原理，基于SSU基因設(shè)計(jì)6個(gè)引物，建立了快速檢測(cè)EHP的LAMP方法。該方法僅35～40 min即可達(dá)到反應(yīng)的平臺(tái)期；對(duì)反應(yīng)裝置要求較低，恒溫水浴鍋、金屬浴或PCR儀均能作為L(zhǎng)AMP的恒溫反應(yīng)裝置，非常適用于在生產(chǎn)一線使用；結(jié)果觀察簡(jiǎn)單，反應(yīng)完畢用肉眼觀察反應(yīng)液的顏色變化即可判斷結(jié)果；特異性良好，與對(duì)蝦常見(jiàn)病毒均無(wú)交叉反應(yīng)；靈敏度是普通PCR方法的100倍。通過(guò)30份樣品的檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，LAMP法與PCR法的檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，PCR法檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性的樣品，LAMP法的檢測(cè)結(jié)果仍然為陽(yáng)性，與其他陽(yáng)性樣品的顯色并無(wú)差異，證明LAMP法的準(zhǔn)確率高且比PCR法更加靈敏。

EHP具有垂直傳播和水平傳播兩種感染方式，且與其他疾病的重要區(qū)別是EHP可以通過(guò)同類間的殘食實(shí)現(xiàn)水平傳播，這使得控制養(yǎng)殖池中的疾病擴(kuò)散變得尤為困難，截至目前還沒(méi)有治療該疾病的藥物。因此養(yǎng)殖過(guò)程中需要認(rèn)真關(guān)注重要的易感染環(huán)節(jié)，從苗種的檢測(cè)、飼料的檢測(cè)、餌料的控制、水體等方面控制EHP的傳播和發(fā)病。上述建立的EHP-LAMP法滿足了對(duì)蝦養(yǎng)殖中對(duì)EHP快速檢測(cè)的需要，為EHP的早期診斷以及防控技術(shù)研究和效果評(píng)估等方面提供了技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 王博雅，王力，劉美如，等.凡納濱對(duì)蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區(qū)的流行情況分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，32（2）：150-154.

（責(zé)任編輯：劉昀）