何薇薇，王曉明，安峰，林維龍

齲是指被酸破壞的牙體組織生成細(xì)菌代謝副產(chǎn)物牙菌斑［1］。牙釉質(zhì)齲早期，牙齒表面近似完整，但表層下由于礦物質(zhì)的丟失而呈現(xiàn)多孔性，致使牙釉質(zhì)表面出現(xiàn)白斑病損。Featherstone［2］認(rèn)為早期牙釉質(zhì)齲是可逆的病變過程，提出現(xiàn)代齲病治療的觀念應(yīng)該從傳統(tǒng)的侵入性治療向非侵入性治療轉(zhuǎn)變，強(qiáng)調(diào)對(duì)白斑病損的早期診斷和治療非常重要。非侵入性治療是采用局部氟移除牙斑來阻止病損的再礦化［3］。而再礦化是在氟化物的協(xié)助下，依靠鈣和磷酸根離子，在去礦質(zhì)作用后重建新的表面［4］。樹脂滲透技術(shù)是近年來阻止白斑病損的新的治療手段，此微創(chuàng)技術(shù)無需犧牲健康的牙體組織，可防止脫礦的牙釉質(zhì)發(fā)生再礦化并可穩(wěn)定已脫礦的牙釉質(zhì)、增強(qiáng)牙釉質(zhì)的強(qiáng)度，充填微孔，阻止齲病的進(jìn)展［5］。這項(xiàng)技術(shù)被認(rèn)為是微觀浸入的，可以縮小非侵入性治療和侵入性治療早期齲的差距，盡可能保存牙體組織的完整性［6］。本研究旨在為臨床上治療早期牙釉質(zhì)齲樹脂材料的選擇應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取張家口沙嶺子屠宰場(chǎng)當(dāng)日新鮮拔除的60顆完整的牛切牙，在室溫下儲(chǔ)存于0.1%酚溶液中。人工齲 脫 礦 液 的 成 分［7］：2.2 mmol/L Ca（NO4）2、2.2 mmol/L KH2PO4、50 mmol/L CH3COOH、5.0 mmol/L NaN3、0.5 mg/L NaF；pH=4.5。人工唾液［8］：碳酸氫鹽（22.1 mmol/L）、鉀（16.1 mmol/L）、鈉（14.5 mmol/L）、磷酸氫鹽（2.6 mmol/L）、硼酸（0.8 mmol/L）、鈣（0.7 mmol/L）、硫氰酸鹽（0.2 mmol/L）、鎂（0.2 mmol/L）；pH值7.4～7.8。滲透樹脂（ICON，德國(guó)DMG公司）；0.05% 氟化鈉溶液（0.05%sodium fluoride solution），自制；2%氟化物凝膠（2%fluoride gel），朗力生物醫(yī)藥（武漢）有限公司；顯微維氏硬度儀（Tunkon 2500，Wilson，美國(guó)）；激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM，OLYMPUS，日本）。

1.2 顯微硬度實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣本的預(yù)備 新鮮拔除的牛切牙30顆，從每個(gè)牙冠上取直徑3 mm、厚2.2 mm的牙釉質(zhì)標(biāo)本，唇面用砂針預(yù)備。將樣本放在底部有一直徑3 mm、深0.1 mm的二類洞的硅模型內(nèi)。樣本用1 200目細(xì)砂打磨，去除部分牙釉質(zhì)，得到厚度2 mm的牙釉質(zhì)樣本。處理好的樣本在顯微鏡下檢查以確定沒有裂縫或其他表面缺損的存在。準(zhǔn)備完成后將樣本儲(chǔ)存到0.1%麝香草酚溶液中避免脫水。所有樣本浸泡于人工齲脫礦液中脫礦24 h，樣本脫礦后可見釉質(zhì)面呈白堊色改變。

1.2.2 顯微硬度的測(cè)量 脫礦后，測(cè)量新的顯微硬度，獲得基線值。根據(jù)治療方法將60例樣本平均分為4組，每組15例。CON（對(duì)照）組：樣本被儲(chǔ)存在5 mL人工唾液8周，每天更換人工唾液。DF組：樣本每天浸泡在1 mL 0.05%氟化鈉溶液中1 min，持續(xù)8周；處理完成后，用去離子水沖洗并儲(chǔ)存在人工唾液中。WF組：樣本每周用1 mL 2%氟化物凝膠涂布表面1 min，持續(xù)8周；處理完成后，用去離子水沖洗并儲(chǔ)存在人工唾液中。IC組：15%鹽酸酸蝕120 s，沖洗干燥30 s，涂干燥劑30 s干燥，用滲透樹脂處理2次，第一次3 min、第二次1 min，每次操作后光照40 s，最后用氧化鋁砂紙拋光（4 000目）20 s。

顯微硬度儀測(cè)定顯微硬度：50 g負(fù)荷的金剛石作用牙釉質(zhì)表面10 s，讀出維氏硬度儀數(shù)值。每組樣本測(cè)量3個(gè)位點(diǎn)，距離100μm；在每個(gè)樣本中心操作，計(jì)算維氏硬度均數(shù)值。所有組的樣本分別測(cè)量4周、8周時(shí)的顯微硬度值。8周后，所有樣本重新浸潤(rùn)到先前的再礦化液中24 h，再次測(cè)量各組的顯微硬度值。

1.3 滲透深度實(shí)驗(yàn)

1.3.1 制備實(shí)驗(yàn)樣本 從60顆牛恒切牙中制取60例牙釉質(zhì)標(biāo)本（6 mm×4 mm×4 mm）并嵌入到甲基丙烯酸樹脂中。每個(gè)樣本的牙釉質(zhì)表面被研磨成平面并拋光，用耐酸性指甲油涂布3個(gè)平行線制作出4個(gè)無保護(hù)的牙釉質(zhì)窗。將標(biāo)本儲(chǔ)存在5 L脫礦液中15 d以制造人工牛切牙釉質(zhì)齲損。每天檢測(cè)pH值（pH=4.5），必要時(shí)用鹽酸或氫氧化鉀溶液調(diào)整。

1.3.2 滲透百分比測(cè)量 60例樣本平均分成4組，除CON組作為對(duì)照儲(chǔ)存在5 mL人工唾液4周，每天更換人工唾液外，其余3組分別用0.05%氟化鈉溶液（DF組）、2%氟化物凝膠（WF組）、滲透樹脂（IC組）處理4周。為了對(duì)釉質(zhì)病變進(jìn)行染色，將樣本浸入到0.1%的羅丹明B乙醇溶液中12 h。然后將60例樣本從牙釉質(zhì)病損表面垂直切開，獲得700μm厚的切片并置于37℃30%過氧化氫溶液中漂白，以從非滲透的多孔結(jié)構(gòu)中去除未被封閉的紅色染料。樣本隨后浸泡于50%乙醇溶液，用熒光素鈉然料標(biāo)記3 min，去離子水沖洗10 s。用激光掃描共聚焦顯微鏡（×100）雙熒光模式觀察樣本。測(cè)量3個(gè)不同位點(diǎn)，其中包括指定位點(diǎn)的病損深度（LD）和滲透深度（PD）；計(jì)算滲透百分比（PP），PP（%）=PD/LD×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，涉及時(shí)間變量的重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析；同一時(shí)間點(diǎn)多組間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組樣本顯微硬度值比較 時(shí)間效應(yīng)與組間干預(yù)效應(yīng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且存在交互作用?；€時(shí)各組間顯微硬度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IC組在4周時(shí)，其他各組在8周時(shí)顯微硬度達(dá)到高峰，再次脫礦后各組顯微硬度值都較第8周有所下降；除基線值外，各時(shí)點(diǎn)IC組均明顯高于其他組（P＜0.05），見表1。

2.2 各組樣本滲透百分比比較 牙釉質(zhì)病損的滲透區(qū)呈現(xiàn)紅色，病損部分和牙本質(zhì)出現(xiàn)綠色，未脫礦的牙釉質(zhì)不存在任何熒光團(tuán)而呈現(xiàn)黑色，見圖1。CON組、DF、WF及IC組的滲透百分比分別為0，（77.87±1.64）%，（76.73±4.06）%和（93.40±2.59）%（F=4 095.489，P＜0.01）。其中 DF、WF、IC 三組的滲透深度值均明顯高于CON組（P＜0.01），IC組的滲透深度值高于DF組和WF組（P＜0.05），DF組和WF組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Comparison of micro-hardness test results between different treatment methods at different time points表1 不同處理方法在不同檢測(cè)時(shí)間的顯微硬度對(duì)比分析結(jié)果 （n=15，kg/mm2，±s）

Tab.1 Comparison of micro-hardness test results between different treatment methods at different time points表1 不同處理方法在不同檢測(cè)時(shí)間的顯微硬度對(duì)比分析結(jié)果 （n=15，kg/mm2，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與 CON 組比較，b與 DF 組比較，c與 WF 組比較，P＜0.05；F 組間=9 336.074，F(xiàn) 時(shí)間=19 882.871，F(xiàn) 交互=2 280.394，均P＜0.01；1 kg/mm2=9.80665 MPa

組別CON組DF組WF組IC組F基線21.24±0.60 21.01±0.37 20.75±0.67 20.68±0.72 2.745 4周52.37±1.63 120.39±2.73a 90.61±2.21ab 230.72±5.39abc 8 012.411＊＊8周67.77±2.19 131.80±1.78a 115.17±3.82ab 230.28±2.65abc 9 451.379＊＊再脫礦41.43±2.08 122.33±7.70a 91.28±1.20ab 180.76±4.91abc 2 290.865＊＊

Fig.1 Observation results of four groups of samples by confocal microscope(×100)圖1 各組樣本的共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果（×100）

3 討論

樹脂滲透技術(shù)是近年來興起的用于治療早期牙釉質(zhì)齲的微創(chuàng)技術(shù)，其原理是利用低黏度樹脂材料的流動(dòng)性，通過毛細(xì)虹吸作用滲入脫礦釉質(zhì)的多孔隙結(jié)構(gòu)，堵塞和充填微孔，從而替代因脫礦而丟失的硬組織，進(jìn)而阻斷早期齲的進(jìn)展，同時(shí)為牙體組織提供機(jī)械性的支持，防止釉質(zhì)表層塌陷及齲壞的進(jìn)一步發(fā)展［8-9］。表面微硬度是衡量釉質(zhì)表面脫礦以及再礦化的重要指標(biāo)，也是臨床評(píng)價(jià)口腔材料的評(píng)價(jià)指標(biāo)關(guān)鍵特性［7］。滲透深度是評(píng)價(jià)樹脂材料進(jìn)入到病變深度并能否有效阻斷齲進(jìn)展的重要因素［6］。既往研究大多只基于微創(chuàng)治療后一次顯微硬度值的測(cè)量，關(guān)于樣本再次被酸侵蝕后顯微硬度是否改變的相關(guān)研究較少。而在實(shí)際臨床使用中，牙齒在口腔中會(huì)經(jīng)常與酸性物質(zhì)接觸，為此本次實(shí)驗(yàn)增加了當(dāng)樣本再次被酸侵蝕后顯微硬度值變化的研究，為臨床應(yīng)用提供更加貼近實(shí)際的參考依據(jù)。

多項(xiàng)研究顯示，齲的滲透技術(shù)作為一種創(chuàng)新方法，可有效限制牙釉質(zhì)齲發(fā)展［6-8，10-12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組顯微硬度達(dá)到峰值時(shí)IC組高于氟化物各組，考慮原因可能是滲透技術(shù)相比氟化物的應(yīng)用，擴(kuò)散的屏障不僅存在于牙釉質(zhì)表面，而是在牙釉質(zhì)齲損內(nèi)制造了一個(gè)擴(kuò)散屏障，用樹脂基質(zhì)增強(qiáng)脫礦牙釉質(zhì)的結(jié)構(gòu)，阻止了齲洞形成［13］。再次脫礦后各組顯微硬度值均較第8周下降，但I(xiàn)C組較其他組表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，表明低黏性樹脂填充剩余晶體多孔可使脫礦的組織再硬化，提高其機(jī)械強(qiáng)度［13］。Takashino等［13-14］研究顯示，盡管樹脂滲透技術(shù)可明顯降低發(fā)生在脫礦狀態(tài)下齲損的進(jìn)展速度，但一些脫礦仍然可發(fā)生在滲透樹脂治療后。本次實(shí)驗(yàn)也得到了相同的結(jié)果，IC組顯微硬度值在第4周達(dá)到峰值，而第8周卻有所下降，考慮可能是由于病損本身剩余礦物的顆粒溶解，病損本身并沒有完全被樹脂基質(zhì)嵌入或在光照時(shí)樹脂收縮造成，有研究認(rèn)為這將導(dǎo)致滲漏和抗酸能力降低［3，15］。

相關(guān)研究顯示，滲透樹脂可通過毛細(xì)作用力滲透到病損表面及內(nèi)部并形成一擴(kuò)散阻礙層［9，15］。牙釉質(zhì)齲表面用15%的鹽酸酸蝕，可有效提高滲透樹脂的滲透能力［16］。另外，滲透樹脂中使用了像乙醇、丙酮等溶劑，其與滲透樹脂中的水呈現(xiàn)出低表面張力和黏度，這些材料顯示更高的滲透系數(shù)［12］。本研究亦顯示，滲透樹脂治療牙釉質(zhì)早期齲其滲透百分比明顯優(yōu)于氟化物各治療組。所以，樹脂滲透技術(shù)的成功依賴這種低黏度樹脂的特性，而且需滲透到白斑的一定深度而不只是掩蓋病損。

另外，在本實(shí)驗(yàn)中，從初始到第4周、第8周，隨著在唾液中浸泡時(shí)間的增加，CON組顯微硬度值逐漸增強(qiáng)，表明唾液具有再礦化的能力，與Paris等［9，11］的研究結(jié)果相近。研究認(rèn)為，氟化物使脫礦更困難，卻有利于再礦化，這是氟化物作用到牙體組織以減少牙齒齲壞的依據(jù)［1］。另有研究顯示，口腔沖洗劑中高濃度氟化物對(duì)早期脫礦的牙釉質(zhì)有再礦化作用，可預(yù)防初期的齲?。?7］。齲病預(yù)防和再礦化的主要方式是低氟水平頻繁接觸［15］。本研究中，每天以0.05%氟化物溶液治療的方案較2%氟化物凝膠每周治療更有效，表明治療頻率較治療藥物的濃度更重要，考慮原因是高濃度氟化物可快速引起礦物沉淀在牙釉質(zhì)表面及牙釉質(zhì)表面細(xì)孔，這些細(xì)孔與深層的脫礦病損相通。相關(guān)研究顯示，氟化物治療這些過程可更進(jìn)一步限制脫礦牙釉質(zhì)表面再礦化［14］。

相關(guān)研究顯示，牛牙釉質(zhì)已被成功充分地應(yīng)用于已發(fā)齲的滲透研究，并且類似的結(jié)果可在人工牙中得到證實(shí)[12，18]。因此，本研究使用牛切牙進(jìn)行牙釉質(zhì)病損的人工誘導(dǎo)，但這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是否能直接適用于自然人牙釉質(zhì)病變還有待探討，也為不同材料的滲透能力研究提供了一個(gè)可能。

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