★ 黃挺 李小英（1.杭州市中醫(yī)院 杭州 310007；.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，薏苡仁味甘淡，性涼，主入脾、胃、肺經(jīng)，具有健脾補(bǔ)肺、利水消腫、舒筋除痹、清熱排膿之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，薏苡仁中含有脂肪酸及脂、多糖類化合物、氨基酸等，具有抗腫瘤，增強(qiáng)機(jī)體免疫，降血糖，抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性［1］?？等R特注射液（Kanglaite Injection，KLT）是從薏苡仁中提取、研制而成的供靜、動(dòng)脈直接輸注的脂肪乳劑，主要成份為薏苡仁油，具有益氣養(yǎng)陰、消癥散結(jié)的作用，臨床上常聯(lián)合放化療或分子靶向藥物用于治療肺癌［2］、肝癌［3］、乳腺癌［4］、結(jié)直腸癌［5］等惡性腫瘤，具有增敏減毒，改善患者生活質(zhì)量，延長生存期，提高機(jī)體免疫力的功效。

自然殺傷細(xì)胞（Nature killer cell，NK細(xì)胞）是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞，形成了人體抗腫瘤和抗病毒感染的第一道防線［6］，其殺傷靶細(xì)胞不需要預(yù)先致敏，且不受MHC限制，是一種安全有效的廣譜抗腫瘤細(xì)胞［7］?；罨腘K細(xì)胞能夠直接溶解主要組織相容性復(fù)合體I（MHC-I）分子缺陷的腫瘤細(xì)胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶B或抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）直接殺傷腫瘤細(xì)胞等靶細(xì)胞，還可分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）等一系列促炎細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)而殺傷腫瘤細(xì)胞［8-9］?？等R特注射液對人NK細(xì)胞的作用，國內(nèi)未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)利用中藥制劑康萊特注射液體外誘導(dǎo)培養(yǎng)人NK細(xì)胞，旨在探討康萊特注射液對人NK細(xì)胞增殖活力、免疫表型及殺傷活性的影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 肺癌A549細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室RPMI1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10%FBS）培養(yǎng)；康萊特注射液購自浙江康萊特藥業(yè)有限公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清（FBS）購自浙江天杭生物科技有限公司；rhIL-2購自北京四環(huán)生物制藥有限公司；人源化CD3單抗購自妙通（上海）生物科技有限公司；CCK-8溶液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；0.25%胰蛋白酶購自加拿大invitrogen公司；熒光標(biāo)記抗體PE-CD3、PE-Cy7-CD56均購自美國eBioscince公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）購自天津市灝洋生物制品科技有限公司；ELISA試劑盒（IFN-γ，TNF-α）購自上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司；Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；酶標(biāo)儀Multiskan FC購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 NK細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增

1.2.1 外周抗凝血采集 選取健康志愿者及2016年3月—8月期間杭州市中醫(yī)院腫瘤科晚期肺癌（腺癌）患者各5例，分別采集肘靜脈血30mL，收集于含10mL肝素的抗凝瓶內(nèi)。

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離 預(yù)先將人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque（密度1.077），加入兩支50mL無菌離心管，10mL每管。用生理鹽水將吸取血漿后的標(biāo)本還原至40mL并充分混勻，緩慢加入在Ficoll-Hypaque上，分離液和血液樣本的體積比為1∶2，2000rpm離心20min，離心完畢，小心吸取白膜層的單個(gè)核細(xì)胞，加生理鹽水補(bǔ)足40mL，2000rpm離心10min，共洗滌3次。

1.2.3 NK細(xì)胞的培養(yǎng)及擴(kuò)增 將PBMC懸浮于NK細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)液+1000IU/mL rhIL-2+100IU/mL青-鏈霉素溶液），調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種至w/2mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加5%自體血漿、10ng/mL CD3單抗，混勻后放置在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此后每隔24h補(bǔ)加CD3單抗10ng/mL，連續(xù)添加4天。細(xì)胞培養(yǎng)至第6天，離心收集細(xì)胞，棄上清，用生理鹽水洗滌1次，加入新鮮NK細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于6孔板中，根據(jù)添加不同濃度的康萊特注射液分為A-E 5組：A組（不加康萊特），B-E組（分別加康萊特0.25、0.5、1、2μL/mL），加入相應(yīng)濃度的康萊特注射液后混勻，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每隔2～3天，根據(jù)細(xì)胞生長情況半量換液，并補(bǔ)加新鮮NK細(xì)胞培養(yǎng)基、5%自體血漿和相應(yīng)濃度的康萊特注射液。若NK細(xì)胞擴(kuò)增狀況良好，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 NK細(xì)胞形態(tài)及增殖能力的分析 誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)的第7、10、15天，在倒置顯微鏡下觀察NK細(xì)胞的形態(tài)，并用0.4%臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色，通過全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測各組NK細(xì)胞濃度，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)（細(xì)胞總數(shù)=培養(yǎng)液總體積×細(xì)胞濃度）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組NK細(xì)胞免疫表型

1.4.1 流式細(xì)胞儀檢測體外擴(kuò)增產(chǎn)物的制備 于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的第15天，將各組培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹勻后分別取2×105個(gè)細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌3次，吸取上清液，沉淀的細(xì)胞加入1mL生理鹽水重懸。

1.4.2 流式抗體的標(biāo)記 空白對照管中不加任何熒光抗體，向CD3單標(biāo)記管中加入5μl PE-CD3熒光抗體，CD56單標(biāo)記管中加入5μl PE-Cy7-CD56熒光抗體，向雙標(biāo)記管中同時(shí)加入5μl PE-CD3熒光抗體和5μl PE-Cy7-CD56熒光抗體，混合均勻，4℃避光靜置30min，1000rpm離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌細(xì)胞2遍，棄上清，沉淀的細(xì)胞加入500μL生理鹽水重懸并轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的BD管中，即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析CD3-CD56+細(xì)胞的百分比。

1.5 ELISA法檢測各組NK細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌量 收集各組體外培養(yǎng)至15天的NK細(xì)胞，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，放置在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育48h后取出，1500rpm離心5min，每孔吸取100μL細(xì)胞上清液，用ELISA法檢測各組NK細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌量。

1.6 CCK-8法檢測NK細(xì)胞的殺傷活性

1.6.1 肺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存的肺癌A549細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗（100IU/mL青-鏈霉素溶液）的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，定期更換培養(yǎng)液，大概有80%～90%鋪滿培養(yǎng)瓶底則可進(jìn)行傳代。

1.6.2 靶細(xì)胞的制備 取對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞，吸走培養(yǎng)液，用生理鹽水清洗細(xì)胞2次，加入37℃預(yù)熱的胰蛋白酶消化貼壁的A549細(xì)胞，待細(xì)胞完全脫落后，加入含10%FBS RPMI1640培養(yǎng)液終止消化，充分吹打細(xì)胞液，將其混勻，計(jì)數(shù)。收集細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL作為靶細(xì)胞。

1.6.3 效應(yīng)細(xì)胞的制備 在各組NK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第15天，將每組培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹勻后，計(jì)數(shù)。收集各組NK細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次，將NK細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL作為效應(yīng)細(xì)胞。

1.6.4 CCK-8法檢測各組NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力 取平底96孔培養(yǎng)板，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分為靶細(xì)胞組、效應(yīng)細(xì)胞組和實(shí)驗(yàn)組，按效靶比10∶1種入效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞。其中靶細(xì)胞組、實(shí)驗(yàn)組提前種入靶細(xì)胞，每孔50μL，96孔板最外周一圈每孔分別加入100μL生理鹽水，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后取出，在倒置顯微鏡下觀察每孔中靶細(xì)胞均已貼壁。吸走培養(yǎng)液，靶細(xì)胞組每孔加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)液100μL。效應(yīng)細(xì)胞組每孔加入效應(yīng)細(xì)胞、RPMI1640培養(yǎng)液各50μL，實(shí)驗(yàn)組每孔加入效應(yīng)細(xì)胞、RPMI1640培養(yǎng)液各50μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h。每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育1-2h，終止培養(yǎng)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測各孔在450nm波長處的光密度（D）值，并計(jì)算殺傷率。NK細(xì)胞殺傷活性（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)細(xì)胞孔OD值）/靶細(xì)胞孔0D值］×100%

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下觀察NK細(xì)胞體積較小，圓形透亮，在培養(yǎng)基中呈懸浮生長。各組NK細(xì)胞在培養(yǎng)第7天開始分裂增殖，細(xì)胞生長快，數(shù)量逐漸增多，各組間差異不明顯。細(xì)胞培養(yǎng)至第10天，A、B、C、D、E組均有細(xì)胞集落形成，但A組和B組細(xì)胞集落體積較小，集落數(shù)較少，而C、D、E組細(xì)胞集落體積較大，集落數(shù)較多，尤以D組最明顯（見圖1）。

2.2 培養(yǎng)第10天、第15天各組NK細(xì)胞增殖情況 患者樣本組中各組NK細(xì)胞增殖情況顯示（見表1），培養(yǎng)至第15天時(shí)，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞數(shù)與不加KLT對照組比較均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），1μL/mL KLT組NK細(xì)胞數(shù)增加最明顯［（33.97±1.97）×106］。

圖1 培養(yǎng)第10天各組NK細(xì)胞鏡下形態(tài)（×400）

表1 患者樣本組各組NK細(xì)胞在培養(yǎng)第10天和第15天的增殖情況（n=5，×106）

健康人樣本組中各組NK細(xì)胞培養(yǎng)至第15天時(shí)，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞數(shù)均比不加KLT對照組顯著增加［（36.13±2.35）×106、（44.29±2.08）×106、（38.17±2.14）×106vs （30.32±1.76）×106，P＜0.05 或P＜0.01］。其中也以 1μL/mL KLT 組 NK細(xì)胞數(shù)增加最明顯。（見表2）。

表2 健康人樣本組各組NK細(xì)胞在培養(yǎng)第10天和第15天的增殖情況（n=5，×106）

2.3 KLT對NK細(xì)胞免疫表型的影響 患者樣本組流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示，1、2μL/mL KLT組NK細(xì)胞中CD3－CD56+細(xì)胞比例較不加KLT對照組明顯升高［（44.74±11.36）%、（36.95±8.37）%vs （21.71±7.64）%，P＜0.01、P＜0.05］。（見表3）。

表3 培養(yǎng)第15天各組NK細(xì)胞CD3－CD56＋細(xì)胞比例（%）

健康人樣本組流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示，0.5～2μL/mL KLT組NK 細(xì)胞中 CD3－CD56+細(xì)胞比例顯著高于不加KLT對照組［（35.13±9.33）%、（46.56±10.78）%、（38.40±8.74）% vs（22.38±8.26）%，P＜0.05或P＜0.01］。（見表 3）。

2.4 各組 NK細(xì)胞IFN-γ、TNF-α分泌水平變化 患者樣本組與健康人樣本組ELISA法檢測結(jié)果均顯示，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α均高于不加KLT對照組（P＜0.05或P＜0.01），以 1μL/mL KLT組 NK 細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α最高，且與其他組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 培養(yǎng)第15天各組NK細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌水平（pg/mL）

2.5 CCK-8法檢測各組NK細(xì)胞殺傷活性結(jié)果 患者 樣 本 組 在 10∶1效 靶 比 時(shí)，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性分別為（53.34±5.42）%、（63.54±5.50）%、（56.55±4.32）%，均明顯高于不加KLT對照組［（41.81±5.66）%］（P＜0.01）。 可 見 1μL/mL KLT 組 NK 細(xì) 胞 殺 傷活性最強(qiáng)，與其他組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 4。

表4 培養(yǎng)第15天10∶1效靶比時(shí)各組NK細(xì)胞對A549細(xì)胞的殺傷率（%）

健康人樣本組在10∶1效靶比時(shí)，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性比不加KLT對照組明顯升高［（54.15±5.86）%、（64.11±3.82）%、（56.91±5.21）% vs（42.39±5.91）%］（P＜0.01），并以1μL/mL KLT組NK細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)，與其他組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

NK細(xì)胞是天然殺傷細(xì)胞，其在發(fā)揮抗腫瘤活性，參與免疫應(yīng)答的過程中，會(huì)在免疫應(yīng)答的早期，通過分泌IFN-γ和TNF-α來實(shí)現(xiàn)其在固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答之間的橋梁作用。體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞在殺傷靶細(xì)胞時(shí)，同樣也會(huì)分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)其活化和殺傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)，患者樣本組和健康人樣本組中，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α均明顯高于不加KLT對照組，并且這三組NK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性也顯著高于對照組。其中1μL/mL KLT組NK細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α的量最多，對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性也最強(qiáng)，兩者結(jié)果相一致。表明康萊特注射液可以通過上調(diào)NK細(xì)胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平進(jìn)一步提高NK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性。

PI3K/AKT通路廣泛存在于細(xì)胞中，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增殖和分化等多種功能，是最主要的抑制細(xì)胞凋亡的信號途徑。許琳等［10］在觀察漢黃芩素對NK細(xì)胞的作用研究中發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，上調(diào)NK細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)，由此認(rèn)為漢黃芩素促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選用具有免疫調(diào)節(jié)功能的康萊特注射液加入到傳統(tǒng)NK細(xì)胞的培養(yǎng)體系中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，患者樣本組和健康人樣本組中，各組NK細(xì)胞增殖均升高。細(xì)胞培養(yǎng)第15天，與對照組比較，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞的增殖均明顯升高，1μL/mL KLT組NK細(xì)胞數(shù)增加最明顯。表明康萊特注射液對NK細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用，這可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

研究表明，康萊特注射液可提高患者的細(xì)胞免疫功能，改善患者生存質(zhì)量。曹向明等［11］研究中發(fā)現(xiàn)康萊特注射液能激活NK細(xì)胞活性，使CD4＋、CD4＋/CD8＋比例上升，促進(jìn)IL-2分泌，激活巨噬細(xì)胞的吞噬能力，從而提高機(jī)體免疫力。本實(shí)驗(yàn)中，各組NK細(xì)胞培養(yǎng)第15天，患者樣本組檢測結(jié)果示，與對照組比較，1～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞中CD3－CD56＋細(xì)胞比例明顯升高。健康人樣本組結(jié)果顯示，0.5～2μL/mL KLT組NK細(xì)胞中CD3－CD56＋細(xì)胞比例明顯高于對照組。表明康萊特注射液能夠提高NK細(xì)胞中CD3－CD56＋細(xì)胞比例。

綜上，康萊特注射液在體外實(shí)驗(yàn)中能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，增加NK細(xì)胞CD3-CD56+細(xì)胞比例，并通過分泌更多的IFN-γ、TNF-α來提高對肺癌A549細(xì)胞的殺傷活性，以上結(jié)論可為康萊特注射液聯(lián)合NK細(xì)胞治療惡性腫瘤提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］肖開, 苗明三.薏苡仁現(xiàn)代研究分析[J].中醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 29(9):1 348-1 350.

［2］王紅艷，湯 虹,吳育鋒，等.康萊特在培美曲塞聯(lián)合順鉑治療晚期肺腺癌中的協(xié)同作用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2016, 13(2):138-141.

［3］Li Y, Zhao XM, Xu HL, et al. Clinical efficacy and Influence of Kanglaite Combined with Chemotherapy on the Activity of Immune Cells in Patients with Liver Cancer [J]. Progress in Modern Biomedicine, 2014,14(11): 2 103-2 106.

［4］Tang CP, Wu Y, Zhou HJ, et al. The chemosensitization effect of Kanglaite injection combined with Paclitaxel in human breast cancer cells [J]. Chongqing Medicine, 2016, 45(24):3 336-3 339.

［5］王艷,陳新,高旭靈.康萊特聯(lián)合替吉奧治療老年中晚期結(jié)直腸癌的臨床研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床, 2015, 30(1):65-69.

［6］Becker PS, Suck G, Nowakowska P, et al. Selection and expansion of natural killer cells for NK cell based immunotherapy [J]. Cancer Immunol Immunother, 2016, 65(4):477-484.

［7］Robertson MJ, Ritz J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells [J]. Blood, 1990, 76(12):2 421-2 438.

［8］Vivier E, Ugolini S, Blaise D, et al. Targeting natural killer cells and natural killer T cells in cancer [J]. Nat Rev Immunol, 2012, 12(4):239-252.

［9］Baggio L, Laureano áM, Silla LM, et al. Natural killer cell adoptive immunotherapy:Coming of age [J]. Clinical Immunology, 2016, 2(3):1 521-1 530.

［10］許琳,王營,陳復(fù)興，等.漢黃芩素對人 NK 細(xì)胞殺傷胃癌 MKN45細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究[J].免疫學(xué)雜志, 2014, 30(9):804-808.

［11］曹向明,沈偉生,舒中琴,等.薏苡仁甘油三酯在吉西他濱三維適形同步放化療治療局部晚期胰腺癌中免疫調(diào)節(jié)功能觀察[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2012, 32(10):1 414-1 416.