向雙云 周珍輝 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 北京 房山 102442）

中藥多糖作為新型的免疫增強劑，以其綠色、安全、高效的特性，在養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛。黃芪多糖(Astragluspolysacchride，APS)是中藥黃芪的主要天然生物活性成分。據(jù)文獻報道，黃芪多糖具有增強機體免疫功能、增加機體主要免疫器官脾臟和法氏囊等重量、增加白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量、提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細(xì)胞活性、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生等作用，對多種疫苗具有免疫增強的作用[1-4]。為進一步明確黃芪多糖對T淋巴細(xì)胞的促進作用，本試驗在雞新城疫免疫過程中添加黃芪多糖作為免疫增強劑，免疫后不同日齡采血測定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，為臨床應(yīng)用免疫增強劑提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗試劑 黃芪多糖注射液(10mg/ml)，購自四川恒通動物制藥有限公司；新城疫Lasota疫苗，購自青島易邦生物工程有限公司。

1.1.2 試驗儀器 離心機(型號為L-500，湖南湘儀儀器廠)，微量移液器(大龍，上海漢林實驗儀器有限公司)，顯微鏡(EX30，舜宇光學(xué)生物有限公司)，電子天平(型號為SL502N，購自上海羽通儀器儀表廠)，高壓蒸汽滅菌器(型號為Q-LS-18S)，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(型號為VS-1300L)，購自蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；

1.1.3 試驗動物 1日齡非免疫健康A(chǔ)A蛋雞90只，由大信禽業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物的分組及飼養(yǎng)管理 90只健康非免疫蛋雞隨機分為3組：黃芪多糖試驗I組、黃芪多糖試驗II組、生理鹽水對照組，每組30只。試驗期間試驗動物采用籠養(yǎng)，全價飼料，自由采食和飲水，1～14日齡采用紅外燈保溫，全日制光照。從4日齡開始，試驗I組注射0.5ml/只黃芪多糖注射液，試驗II組注射0.8ml/只黃芪多糖注射液，生理鹽水對照組注射0.75ml/只滅菌生理鹽水。1次/d，連續(xù)3d。7日齡用新城疫Lasota疫苗滴鼻、點眼免疫。

1.2.2 T淋巴細(xì)胞的測定 （1）采血：于免疫前1d和免疫后1、2、3、4、5、6周每組隨機抽取10只雞，翅靜脈采取抗凝血，2ml/只，加入等量的Hank’s液稀釋，手動輕輕搖勻。（2）分離淋巴細(xì)胞：取2支干凈的15ml離心管，分別加入2ml淋巴細(xì)胞分離液。用移液器吸取等量的靜脈血和Hank’s的混合液，貼管壁緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液的液面上，注意保持兩種液面界面清晰，不要打破液面。室溫下立即置離心機中2000r/min離心30min。離心后分為4層，用移液器將血漿和分離液之間的乳白色層(即淋巴細(xì)胞層)細(xì)胞懸液仔細(xì)全部吸取至另一刻度離心管中。用5倍以上體積的Hank’s液洗滌3次，每次以1500r/min離心10min，棄上清，沉淀主要為淋巴細(xì)胞。取沉淀用pH7.4含10%小牛血清和5.0g/L水解乳蛋白的Hank’s液配成1×106～2×106/ml的細(xì)胞懸液備用。（3）制備綿羊紅細(xì)胞懸液：無菌操作新鮮采集綿羊靜脈抗凝血，用兩個15ml離心管裝血液。用Hank’s液洗滌3次，前兩次1500r/m離心10min，末次2000r/m離心10min后，將壓積綿羊紅細(xì)胞用Hank’s液配成1%SRBC(綿羊紅細(xì)胞懸液)。（4）淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞作用：用移液器分別取0.1ml淋巴細(xì)胞懸液，分別貼壁加入2支離心管(1.5ml)中，再貼壁加入等量的1%SRBC和等量的滅活的小牛血清混勻，置37℃水浴25min，期間搖動2～3次，取出后置4℃冰箱作用2h。（5）制片、鏡檢、計數(shù)：從冰箱取出離心管，500r/min離心5min，棄去上清液，輕輕混勻細(xì)胞懸液。取1滴細(xì)胞懸液置于事先滴有1滴美蘭染色液的載玻片上，蓋上蓋玻片，用高倍顯微鏡進行觀察和計數(shù)。鏡下淋巴細(xì)胞呈藍紫色或淡藍色，紅細(xì)胞為無色。凡能結(jié)合3個以上綿羊紅細(xì)胞者為玫瑰花環(huán)形成陽性細(xì)胞，常規(guī)計數(shù)200個淋巴細(xì)胞，計算玫瑰花環(huán)形成陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，即T淋巴細(xì)胞的百分率。

2 試驗結(jié)果

附表 T淋巴細(xì)胞測定結(jié)果

由表1可見，黃芪多糖試驗I組和試驗II組在免疫后不同時段的T淋巴細(xì)胞百分率均高于生理鹽水對照組，差異顯著(P＜0.05)，黃芪多糖試驗I組和試驗II組之間差異不顯著(P＞0.05)。說明在進行雞新城疫Lasota疫苗免疫前，提前注射黃芪多糖能顯著提高T淋巴細(xì)胞百分率。

3 討論與結(jié)論

T淋巴細(xì)胞是機體主要的淋巴細(xì)胞之一，在免疫應(yīng)答中起核心作用，T淋巴細(xì)胞百分率是檢測機體細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)，在研究及篩選免疫增強性藥物等方面具有重要意義[5]。試驗結(jié)果表明：黃芪多糖試驗I組、試驗II組T淋巴細(xì)胞的百分率高于對照組，差異顯著；黃芪多糖試驗I組和試驗II組之間差異不顯著，但試驗II組的各項指標(biāo)略高于試驗I組，表明黃芪多糖在雞新城疫Lasota疫苗免疫過程中能提高T淋巴細(xì)胞百分率，黃芪多糖可以作為雞新城疫Lasota疫苗的免疫增強劑。

[1]Qiu Y, Hu Y L, Cui B A, et al. Immunopotentiating effects of four Chinese herbal polysaccharides administered vaccination in chickens[J]．Poultry Science, 2007, 86(12)： 2530-2535.

[2]毛小娟. 紅芪和黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 1988(6)： 365.

[3]林繼和, 姚中磊, 王世杰. 復(fù)方中藥對免疫新城疫和禽流感疫苗三黃雞抗體產(chǎn)生的影響[J]. 中國家禽, 2011, 33(9)： 64-65.

[4]王福厚, 張進隆, 劉根新. 黃芪多糖、當(dāng)歸多糖對雞新城疫弱毒苗免疫增強作用[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2011, 30(4)： 1-2.

[5]崔治中, 崔保安. 獸醫(yī)免疫學(xué)[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2014.