張 亮，王振龍，高志文，馬 晶，樊明瑞，韓志校

(1.山西省太原市林業(yè)科學(xué)研究所，山西 太原 030009；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071000 )

旱柳(SalixmatsudanaKoidz.)，屬于楊柳科柳屬落葉大喬木，其分布廣泛，在全國各地都有栽培，主要品種與變種有饅頭柳、絳柳、龍須柳等。它是防護(hù)林、水土保持林、園林綠化林及用材林的重要組成樹種，具有較高的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。古樹是有生命的活化石，是大自然給人類的寶貴財(cái)富，具有重要的科研、歷史、文化價(jià)值，保護(hù)好它們有著十分重要的意義。

SSR已成為在生物上應(yīng)用最廣、最為重要的分子標(biāo)記。目前，SSR標(biāo)記已經(jīng)在眾多植物種類中得到證實(shí)和應(yīng)用,例如,葡萄、松樹等物種。而柳樹分子標(biāo)記的研究始于20世紀(jì)90年代，如，王輝等利用SSR標(biāo)記的方法對楊柳樹遺傳多樣性進(jìn)行了分析，劉恩英建立和優(yōu)化了柳樹SSR反應(yīng)體系，王源秀利用杞柳和簸箕柳候選雜交親本對其SSR指紋進(jìn)行了分析等。而對山西省不同地區(qū)旱柳古樹資源遺傳多樣性的SSR研究還未見報(bào)道。筆者嘗試用SSR分子標(biāo)記的方法對采自山西省7個地區(qū)的49份旱柳古樹材料進(jìn)行遺傳多樣性檢測，旨在從DNA分子水平闡明其地區(qū)間的遺傳差異，為旱柳古樹資源的有效保護(hù)，柳樹新品種的選育及遺傳改良抗性研究提供理論支持，并從分子水平上豐富對古樹的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

2009年至2011年，太原市林業(yè)科學(xué)研究所柳樹課題組收集了山西省境內(nèi)的古旱柳品種(見圖1)。通過嫁接復(fù)壯、扦插等繁殖手段，至2012年已培育出49個合格的古旱柳品種2年生苗木各200株。于當(dāng)年秋季苗木生長停止后，在樹冠1/3處，采集枝條、葉片等材料，封裝進(jìn)冷藏保溫箱并做好標(biāo)記，在4 h內(nèi)送至河北農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行試驗(yàn)。

圖1 供試材料所在地理位置及取樣情況

1.2 方法

基因組DNA提取采用改良的CTAB法。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定純度后，再用ddH2O稀釋至20 ng/μL左右。

試劑：所用引物均來自文獻(xiàn)[12-13]，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。2×Taq MasterMix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

PCR反應(yīng)體系：柳樹DNA基因組SSR-PCR 10 μL 反應(yīng)中最優(yōu)條件為2×Taq MasterMix 5μL，引物濃度為1.0 μmol/L,H2O為3μL,DNA為1μL.

PCR擴(kuò)增反應(yīng)：PCR擴(kuò)增94 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃變性50 s，52 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)。最后一個循環(huán)結(jié)束后，再72 ℃延伸7 min，得擴(kuò)增產(chǎn)物。

反應(yīng)產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳40 min左右，取出進(jìn)行AgNO3染色。再用顯色液(1.5%NaOH，0.4%甲醛)顯色，直至條帶清晰為止，照相并記錄。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

選擇擴(kuò)增條帶清晰且有多態(tài)性的SSR標(biāo)記進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，假定膠上遷移率相同的條帶均來自同一位點(diǎn)上的同一等位基因。對每個樣品的擴(kuò)增電泳譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶記為1，無帶或模糊的記為0，形成0/1數(shù)據(jù)矩陣輸入Excel中。SSR數(shù)據(jù)用POPGENE32和DPS軟件進(jìn)行遺傳多樣性數(shù)據(jù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 古旱柳引物篩選與多態(tài)性分析

從25對引物中選取10對擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、特異性高的引物。這10對引物在7個地區(qū)的49個旱柳古樹品種中共擴(kuò)增出條帶33條，其中多態(tài)性條帶26條，占78.79%(如表1).每對引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為2～5，平均每對引物擴(kuò)增3.3個位點(diǎn)。

表1 引物多態(tài)性分析

從擴(kuò)增結(jié)果來看，SSR引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小主要分布在80 bp～320 bp之間。其中引物SB24，SB233，GslMCT011，ORNL140多態(tài)性最高，達(dá)到100%；ORPM-028多態(tài)性最低，為50%；其余引物介于兩者之間。

圖2為引物SB24和引物ORPM-028擴(kuò)增出的部分樣品圖譜。

圖2 SB24引物和ORPM-028引物對供試的部分旱柳古樹的SSR擴(kuò)增譜帶

從圖2可以看出，不同引物在相同材料中產(chǎn)生的譜帶信息不同，同一引物在不同的材料中產(chǎn)生的譜帶信息也不相同。這說明供試的旱柳古樹在DNA+水平上具有一定的差異。

2.2 古旱柳種群內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)

地區(qū)間旱柳古樹的多態(tài)位點(diǎn)百分率、Nei′s基因多樣性和有效等位基因范圍分別為39.39%～69.70%，0.121 6～0.208 6和1.189 3～1.341 2,見表2.

表2 7個地區(qū)間旱柳古樹資源的遺傳多樣性參數(shù)值

從表2中可以看出,7個地區(qū)間多態(tài)性比率差異較大，在39.39%～69.70%之間。其中朔州(地區(qū)B)地區(qū)的多態(tài)性比率最高，達(dá)到了69.70%；晉中(地區(qū)E)、臨汾(地區(qū)G)、呂梁(地區(qū)F)最低，為39.39%.7個地區(qū)的多態(tài)性高低為：B>A>C>D>E，G，F(xiàn).各群體間Nei′s基因多樣性和有效等位基因排列與多態(tài)位點(diǎn)百分率一致。

2.3 古旱柳群體間遺傳一致度及遺傳距離

古旱柳群體的遺傳一致度(I)與遺傳距離(D)見表3.

表3 旱柳古樹群體的遺傳一致度與遺傳距離

由POPGENE32軟件計(jì)算的7個地區(qū)間旱柳古樹的遺傳距離和遺傳一致度表明，古旱柳群體間的遺傳一致度很高(0.865 1～0.990 7)，尤其是地區(qū)C與地區(qū)D之間遺傳相似度最大(0.990 7)，接近于1，表明兩個地區(qū)幾乎沒有分化。地區(qū)E與地區(qū)G之間的遺傳一致度最低(0.865 1)。遺傳距離在地區(qū)E和地區(qū)G之間最大(D=0.144 9)，地區(qū)C和地區(qū)D之間最小(D=0.009 4)。

不同地區(qū)旱柳古樹的遺傳聚類圖見圖3.

圖3 不同地區(qū)旱柳古樹的遺傳聚類圖

由圖3可以看出，7個地區(qū)的旱柳古樹資源通過聚類分成了兩大類，第Ⅰ類為：大同(地區(qū)A)、朔州(地區(qū)B)、忻州(地區(qū)C)、太原(地區(qū)D)、晉中(地區(qū)E)、呂梁(地區(qū)F)；第Ⅱ類為：臨汾(地區(qū)G)。這也說明了處在山西省中北部6個地區(qū)的旱柳古樹聚在了一起，而處在南部臨汾地區(qū)的單獨(dú)聚在了一起。

2.4 不同地區(qū)古旱柳材料的聚類分析

利用DPS軟件中的UPGMA法對分布在山西省7個地區(qū)的49份旱柳古樹材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4.

圖4 不同地區(qū)旱柳古樹植株的遺傳聚類分析

由圖4可以看出，在遺傳距離為0.53處，所有植株可以分為兩類：一類是包括所有地區(qū)的40個古旱柳品種；一類是包括大同、朔州、忻州3個地區(qū)的9個古旱柳品種。說明這9個品種與上述40個古旱柳品種有一定的差異性，同時，49個古旱柳品種個體的聚類結(jié)果與7個地區(qū)間的聚類有差別。

3 討論與結(jié)論

研究表明，一個物種遺傳多樣性越高，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新環(huán)境。筆者用10對引物對采自山西省7個地區(qū)的49個旱柳古樹植株進(jìn)行了地區(qū)間遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，其具有豐富的遺傳多樣性。選用的10對引物共擴(kuò)增出條帶33條，其中多態(tài)性條帶有26條，占78.79%.由此可見，這7個地區(qū)的旱柳古樹材料具有比較豐富的SSR多態(tài)性。

Nei′s遺傳多樣性揭示了各地區(qū)間遺傳多樣性水平，利用SSR分子標(biāo)記方法測得的7個地區(qū)旱柳古樹的Nei′s遺傳多樣性范圍為0.121 6～0.208 6，均值為0.165 3，其排列順序依次是：朔州>大同>忻州>太原>晉中、臨汾、呂梁,它與地區(qū)間的多態(tài)性比率一致。說明這7個地區(qū)間旱柳古樹具有較豐富的遺傳多樣性。

通過對這7個地區(qū)的旱柳古樹進(jìn)行聚類分析可知，地區(qū)間的遺傳一致度很高，尤其是地區(qū)C與地區(qū)D之間遺傳相似度最大，接近于1，表明兩地區(qū)幾乎沒有分化；地區(qū)E與地區(qū)G之間的遺傳一致度最低。7個地區(qū)間聚類結(jié)果得到兩類，并且具有地理相關(guān)性，一類是種植在山西省中北部6個地區(qū)的旱柳古樹，一類是種植在山西省南部臨汾地區(qū)的旱柳古樹。

對來自這7個地區(qū)的49個品種個體之間的聚類結(jié)果表明，雖然柳樹主要是通過無性繁殖，但是來自山西省7個不同地區(qū)的49個旱柳古樹品種間卻存在遺傳差異，并非起源于同一無性系。另外，49個旱柳古樹材料聚類結(jié)果呈現(xiàn)混雜性，并不是同一種植地區(qū)的植株聚在一起。說明這些古旱柳個體是在幾十年至幾百年前栽種的，由于時間不同，應(yīng)用的品種可能不同。雖然是在同一地區(qū)甚至同一地點(diǎn)收集的旱柳古樹，其遺傳差異也可能會很大。從而也進(jìn)一步說明了這些旱柳古樹具有廣泛的遺傳多樣性。

山西省旱柳古樹存在廣泛的遺傳多樣性，是寶貴的遺傳資源，應(yīng)加大保護(hù)和研究力度，為柳樹的遺傳改良提供育種材料。

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