楊震飛， 劉波、2， 戈賢平、2， 宋長友， 張慧敏， 單凡

(1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇無錫214081；2.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫214081)

在一定的環(huán)境條件下，由于外界環(huán)境因素的負面影響，使動物無法維持正常的生理狀態(tài)，稱為環(huán)境脅迫 (environmental stress)，也叫環(huán)境應激。生物總會受到生存環(huán)境中各種環(huán)境因子的刺激，且刺激與生物有機體總是處于相互作用的動態(tài)過程中。近年來，隨著工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖模式迅速發(fā)展，其集約化程度越來越高。在集約化養(yǎng)殖中，養(yǎng)殖密度的提高會產(chǎn)生一系列不利于魚類生長的環(huán)境脅迫，引起水質(zhì)惡化，影響魚類的成活率、生長、健康、福利和產(chǎn)量[1]。

經(jīng)典遺傳學認為，遺傳的分子基礎是核酸，核酸的堿基序列上包含生物體的所有遺傳信息，幾乎所有的生命活動均由基因調(diào)控。然而，生物體是一個復雜的系統(tǒng)，不是一種因素就能決定整個生命活動。隨著遺傳學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)基因表達模式的改變是由一些DNA或染色質(zhì)水平的修飾引起的。表觀遺傳 (epigenetics)是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是細胞內(nèi)除遺傳信息外其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，且這種改變在發(fā)育和細胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞[2]。它是一種全新的遺傳機制，因為它不涉及DNA序列的改變，不符合孟德爾的遺傳方式。在遺傳學研究中，人們發(fā)現(xiàn)了表觀遺傳有多種修飾方式，包括DNA甲基化作用、組蛋白修飾作用、非編碼RNA作用等，而且探究了其錯綜復雜的生物學作用。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳與外界環(huán)境刺激有密切的關系[3]，由于外界環(huán)境對機體刺激的影響，任何一種調(diào)節(jié)機制發(fā)生紊亂都能導致細胞活動發(fā)生異常，從而引起各種疾病[4]。已有研究表明，環(huán)境脅迫能調(diào)控水生生物基因的表達，影響水生生物的表型性狀，并且在一定程度上改變遺傳信息并傳遞到下一代，進而影響下一代的表型性狀。本研究中，就水產(chǎn)養(yǎng)殖中環(huán)境脅迫與表觀遺傳調(diào)控的研究進展做一綜述，以期為進一步研究環(huán)境因素與基因互作關系提供理論參考。

1 表觀遺傳學的基本要素

表觀遺傳是指基因的表達發(fā)生可遺傳的變異現(xiàn)象，而基因序列不發(fā)生改變[5]，是生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)和環(huán)境因素共同作用的結果，主要包括4個方面:DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控等[6]。

1.1 DNA甲基化修飾

1.1.1 DNA甲基化 DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶 (DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，通過S－腺苷－L－甲硫氨酸 (S－adenymethionine，SAH)提供甲基供體，將甲基轉移到脫氧胞嘧啶環(huán)第5位碳原子上形成甲基化脫氧胞嘧啶共價修飾[7]，DNA甲基化過程由DNA轉移酶家族(DNMTS)中的維持甲基化轉移酶 (DNMT1)和重新甲基化轉移酶 (DNMT3A和DNMT3B)參與完成，其中DNMT1主要負責DNA復制后的甲基化，以保證子鏈和親鏈具有相同的甲基化模式；DNMT3A和DNMT3B則主要負責對未甲基化兩條鏈的甲基化過程，以及發(fā)育過程中DNA的重新甲基化，也參與了異常甲基化過程[8－10]。

DNA甲基化主要發(fā)生在CPG島上，CPG島通常存在許多重要的基因啟動子區(qū)。DNA的高度甲基化會影響基因的結構，進而影響RNA轉錄，引起基因沉默。正常的DNA甲基化是調(diào)控生物體基因表達的重要方式之一，參與較多生理過程，如維持染色體結構、胚胎發(fā)育、細胞分化、X染色體失活、肌生成等。而異常的DNA甲基化則會引發(fā)疾病，近年來研究表明，遺傳過程中存在類似DNA甲基化作用的其他表觀遺傳修飾 (如羥基化)，這些作用可能與魚類的生長發(fā)育存在密切的關系[11]。1.1.2 DNA去甲基化 DNA的去甲基化同DNA的甲基化一樣，在基因的表達過程中扮演著非常重要的作用。DNA去甲基化的兩個主要過程是主動去甲基化 (Active DNA demethylation)和被動去甲基化 (Passive DNA demethylation)。在 DNA去甲基酶參與過程下形成的去甲基化為主動去甲基化，而在DNA的復制過程中，由于DNA的甲基化維持機制受損導致的去甲基化為被動去甲基化。

DNA的去甲基化主要是由10－11轉置蛋白(Ten－Eleven Translocation，TET)介導的去甲基化過程[12]。 TET1可催化 5－MEC形成 5－HMC(5－h(huán)ydroxymethylcytosine)。 5－HMC 中間體在 5－MEC變成非甲基化C中起著重要作用[13]。沉默抑制因子 (Repressor of Silencing 1，ROSl)是擬南芥Arabidopsis thaliana體內(nèi)的一種DNA去甲基化酶，具有裂解酶和糖基化酶的活性，同時含有核酸內(nèi)切酶結合域，從而介導DNA去甲基化。ROS1突變會導致一些內(nèi)源位點和轉基因位點的高度甲基化，同時也會對DNA損傷試劑敏感[14]。ROS4具有乙酰轉移酶的活性，是催化組蛋白H3乙?；闹饕钚晕镔|(zhì)，ROS4傾向于結合不含有修飾的核小體的特異甲基化DNA，組蛋白的乙?；癁槿旧w創(chuàng)造一個相對松散的環(huán)境，利于ROS1發(fā)揮作用，同時DNA甲基化減少蛋白 (Decrease in DNA methylation1，DDM1) 的功能也需要 ROS1的參與[15－16]。ROS5具有Α晶體狀結構規(guī)域，編碼一個熱激蛋白，可以同ROS4和ROS1互化，同時也影響DNA去甲基化和組蛋白的修飾[17－18]。近些年相關研究發(fā)現(xiàn)，AP核酸內(nèi)切酶和堿基切除修復途徑X線修復交叉互補基因 (X－ray repair cross－complementing1 XRCC1)也參與 DNA去甲基化途徑[19－20]。同時也有研究表明，甲基化胞嘧啶結合蛋白(Methylcytosine－Binding Protein， MBD4) 可結合含有DNA甲基化的位點，指導DNA的去甲基化[21－22]。

1.2 組蛋白修飾

1.2.1 組蛋白修飾 組蛋白修飾是另一個主要的表觀遺傳過程 (圖1)。組蛋白修飾包括一系列的轉錄后修飾，如甲基化、乙?；⑸秕；?、磷酸化、泛素化等[23－24]。乙?；M蛋白與活化基因相關，而去乙?；ǔＥc轉錄沉默相關[25]。組蛋白甲基化對基因活性有著不同的影響，組蛋白H3第4位賴氨酸 (K4)甲基化通常和增加基因活性相關，而組蛋白H3第9位賴氨酸 (K9)甲基化可能導致轉錄抑制。更重要的可能是DNA甲基化與組蛋白修飾通常共同起作用[26]，比如，胞嘧啶的甲基化可能有助于H3K9的甲基化。同時，H3K9甲基化可能促進胞嘧啶的甲基化進而導致基因下調(diào)。通常DNA甲基化和組蛋白甲基化修飾相互依賴的起作用進而調(diào)控整體染色體的狀態(tài)。早期研究發(fā)現(xiàn)，高乙?；M蛋白和轉錄活化基因相關，組蛋白乙?；兄诨虻霓D錄[27－28]。實際上，組蛋白乙?；幕瘜W性質(zhì)表明了其可能促進基因表達的一個機制。組蛋白甲基化被當作調(diào)控元件，在許多真核生物啟動子區(qū)域富集H3K4me3，但H3K4甲基轉移酶較少[29]。在體外，H3K4me3通過果蠅Drosophila melanogaster、人類多梳抑制性復合物 2(Polycomb RepressiveComplex2， PRC2) 抑制H3K27 三甲基化[30]。此外，H3K9me3 和H3K27me3也與異染色質(zhì)的形成以及多梳沉默相關。組蛋白磷酸化影響其修飾位點殘基的正電荷，表明組蛋白磷酸化與乙?；邢嗨频恼{(diào)節(jié)核小體動力學機制[31]。

1.2.2 組蛋白去甲基化去乙酰化調(diào)節(jié)機制 組蛋白甲基化也是動態(tài)的，賴氨酸特異性去甲基化酶1(Lysine Specific Demethylase1，LSD1)是一種組蛋白去甲基化酶，也是一種胺氧化酶，可在輔基存在的條件下進行胺氧化反應催化去除H3K4結構位點的二甲基化和單甲基化，進一步研究發(fā)現(xiàn)，LSD1在雄激素受體引導下也可去除H3K4的二甲基化[32]。另一類組蛋白去甲基化酶是含有JmjC結構域的蛋白 (JmjC Domain Containing Protein，JMJ)類蛋白，也是最大的一類去甲基化酶，可去除多甲基化修飾包括無法去除的三甲基化蛋白，并通過活性中心結構域?qū)谆鶊F進行氧化反應，再脫去水釋放甲酸而將甲基去除[33]。類蛋白通過去組蛋白甲基化以及與其他染色質(zhì)修飾相互協(xié)作等方式參與了眾多的基因表達和染色質(zhì)活動的調(diào)控，涉及到了代謝、發(fā)育和環(huán)境適應等生物學過程。

組蛋白的乙酰化和去乙?；l(fā)生在不同組蛋白的不同位點。DNA與組蛋白間、核小體與核小體間相互作用的強度可通過組蛋白賴氨酸殘基加上乙酰化修飾后中和自身的正電荷來改變[34]。每種生物均含有多種組蛋白乙酰轉移酶和去乙?；?，組蛋白乙酰轉移酶和去乙?；缸R別的位點一般不止一個，這與組蛋白甲基轉移酶有較大不同?；虻霓D錄激活同樣離不開組蛋白的去乙?；揎?。HOS2是Ⅰ型組蛋白去乙?；福P于HOS2對基因的轉錄調(diào)控機制的觀點認為:一般表達量高的基因均需要組蛋白的多種修飾以及多個轉錄激活因子的激活作用，但這些修飾可能成為后期轉錄的障礙[35]。因此，對于需要多輪轉錄的基因來說，組蛋白去乙?；窰OS2負責恢復轉錄后染色質(zhì)的結構，以方便下一輪轉錄。

1.3 染色質(zhì)重塑

染色質(zhì)重塑是指在整個細胞分裂周期中染色質(zhì)的位置和結構發(fā)生改變[36]。染色質(zhì)重塑發(fā)生時，在核小體連接處染色質(zhì)狀態(tài)變得相對疏松，這使得啟動子區(qū)中的順式作用元件暴露，為順式作用元件與轉錄因子結合提供盡可能多的接觸空間。染色質(zhì)重塑與部分依賴能量供給的組蛋白修飾密切聯(lián)系，會誘導許多蛋白－DNA及蛋白－蛋白間的關聯(lián)受到破壞。2種蛋白復合體 (ATP依賴型核小體重構復合體和組蛋白修飾復合體)會通過水解作用誘導核小體的構型發(fā)生變化[37]，后者可以催化核心組蛋白N端尾部的共價修飾 (賴氨酸的乙?；胺核鼗⒕彼岷唾嚢彼岬募谆?、谷氨酸的多聚ADP核糖基化等)[38]。通過組蛋白修飾酶的作用破壞基因組DNA與組蛋白尾部及核小體之間的相互作用也可以引起染色質(zhì)重塑[39－40]；另外，染色質(zhì)重塑也可為基因表達相關的蛋白及高級染色質(zhì)結構的組織者提供識別位點，經(jīng)過修飾的組蛋白也可作為染色質(zhì)特異位點的標志[23，41]。ATPase亞基存在于所有ATP依賴型核小體重構復合體中，根據(jù)亞基的同源性可分為 ISWI、SWI/SNF、CHD、INO80、RAD54亞家族[42]。酵母交換型轉換/蔗糖不發(fā)酵復合物 (SWI/SNF)是第一個在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中發(fā)現(xiàn)并被確認的ATP依賴的重塑復合體[43]。

1.4 非編碼RNA調(diào)控

非編碼RNA是各種不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA的統(tǒng)稱，非編碼RNA在基因的表達過程中同樣扮演重要的角色[44]，包括參與基因轉錄、翻譯等調(diào)控過程，催化RNA前體中內(nèi)含子的剪切、DNA復制、調(diào)控細胞發(fā)育和分化等[45－48](圖2)。

1.4.1 小分子RNA對基因轉錄的調(diào)控 小分子RNA主要有microRNA、siRNA、piRNA和啟動子附近產(chǎn)生的一類RNA，micRNA和siRNA通過在細胞質(zhì)中組建RISC復合物誘導Argonaute蛋白與特定區(qū)域的靶標RNA結合實現(xiàn)對基因的沉默，然而Argonaute蛋白在 RNA干擾 (RNA interference，RNAi)通路及在細胞核內(nèi)的存在形式在表觀遺傳調(diào)控上的作用為這套系統(tǒng)賦予了多層面、更復雜的功能。miR－320由基因POLR3D啟動子區(qū)域反義方向轉錄產(chǎn)生，miR－320可以介導 Argonaute－1(AGO1)蛋白與RRC2復合物組分EZH2之間的相互作用，也可以將啟動子區(qū)域組蛋白H3上第27位賴氨酸的三甲基化 (H3K27me3)，從而抑制POLR3D基因的轉錄[49]。

1.4.2 長鏈非編碼RNA對基因轉錄的調(diào)控 長鏈非編碼RNA是一類不具有編譯蛋白質(zhì)能力的RNA，研究發(fā)現(xiàn)，影響DNA甲基化的RNA許多為編碼蛋白質(zhì)的mRNA的反義轉錄產(chǎn)物，如LUC7L和P53的反義RNA，WRAP53、HBA1(Haemoglobin α1)的反義RNA。WRAP53是通過與CTCF結合調(diào)節(jié)P53基因的表達，而LUC7L則是通過甲基化啟動子區(qū)CPG島抑制基因轉錄。作為支架招募組蛋白修飾相關的復合物是長鏈非編碼RNA調(diào)控基因轉錄的一種重要方式，通過對染色質(zhì)組蛋白進行甲基化或乙?；揎椪{(diào)節(jié)基因的表達[50]。

2 環(huán)境脅迫對養(yǎng)殖魚類表觀遺傳的影響

水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境脅迫按性質(zhì)可分為:物理、化學、生物和人為因子等4種[51]。物理脅迫因子是由物理因素對機體造成的應激，包括高溫、低溫及其溫度的劇變，以及光照、噪音等；化學脅迫因子源包括有機物和重金屬污染，亞硝酸鹽及氨氮濃度的過高，以及鹽度、pH變化等；生物脅迫因子包括養(yǎng)殖密度過高導致的擁擠應激、營養(yǎng)缺乏或過剩、魚類雌雄分化和生活習性等；人為脅迫因子包括養(yǎng)殖過程中人為的捕捉、分池、運輸和病害處理等造成的應激。

2.1 主要物理脅迫對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的表觀遺傳效應

2.1.1 溫度 魚類屬于變溫動物，有適宜的生長與繁育溫度，存在生命活動的低溫與高溫極限。Liu等[52]研究發(fā)現(xiàn)，高溫應激可顯著提高團頭魴Megalobrama amblycephala血清促腎上腺激素和皮質(zhì)醇水平，并誘導氧化應激，促進 HSP60、HSP70、HSP90基因的表達。在對歐洲鱸歐洲鱸Dicentrarchus labrax的研究中發(fā)現(xiàn)，在性腺成熟前溫度可以影響性別比例，在水溫較高情況下，雄魚比例大于雌魚，雄性鱸魚幼魚性腺內(nèi)的CYP19A啟動子甲基化水平顯著高于雌性幼魚，在高溫刺激下，雌魚CYP19A基因的啟動子甲基化水平明顯上升，說明DNA甲基化參與基因調(diào)控誘導性別分化，并且在該過程中CYP19A基因的表達與DNA甲基化水平呈現(xiàn)反比的關系[53]，個體CYP19A基因的啟動子甲基化水平的變化過程發(fā)生在生殖腺而非其他組織中，說明這不是一個普通的溫度效應，而且這些影響在性別未分化和未經(jīng)雌激素處理的魚中同樣可以檢測到，因此，在溫度誘導雄魚產(chǎn)生的過程中，CYP19A基因啟動子甲基化扮演了重要的角色。在體外條件下，溫度會誘導歐洲鱸魚個體CYP19A基因啟動子發(fā)生甲基化，SF－1和FoxI2基因的表達會受到抑制，推測CYP19A基因啟動子甲基化可能是生物體在漫長的進化過程中，形成的一種對溫度適應的機制[53]。Jabbari等[54]發(fā)現(xiàn)，變溫的魚類和兩棲類動物DNA甲基化水平是恒溫的鳥類和哺乳類動物的2倍，并且他還發(fā)現(xiàn)，南極魚類DNA甲基化水平高于熱帶魚類。有研究表明，魚類的肌纖維生成過程及魚類肌肉分化相關的基因表達與孵化溫度有密切的關系，斑馬魚Danio rerio胚胎在26℃孵化條件下，其成年個體肌纖維數(shù)量比低溫 (22℃)和高溫 (31℃)條件孵化的個體增加了14%～19%[55]。在對刺參Apostichopus japonicus的研究中發(fā)現(xiàn)，高溫應激會促進 DNMT1、HDAC3和MLL5基因的表達[56]。河豚魚胚胎孵化后期，溫度升高會促進FoxK1基因轉錄水平[57]。斑馬魚胚胎在23、27、31℃條件下孵化，選擇發(fā)育過程中的6個時間點檢測DNMTS基因的表達情況，結果顯示，DNMT3基因表達在發(fā)育前期有顯著的動態(tài)變化趨勢，尤其是DNMT3A的mRNA的轉錄水平在孵化時期顯著增加，同時在相同發(fā)育階段，發(fā)現(xiàn)不同孵化溫度組中DNMT3A和DNMT3B基因表達有顯著差異，由此推測，魚類發(fā)育前期階段，DNMT3A和DNMT3B基因在溫度的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮著不同的作用[58]。羅非魚 Oreochromis mossambicus耐寒品系DNA甲基化總體水平相比于對照組基因組明顯下降，經(jīng)過連續(xù)多代的低溫脅迫可引起尼羅羅非魚DNA甲基化水平及狀態(tài)發(fā)生改變，這說明羅非魚抗寒性能與DNA甲基化密切相關[59]。

總的來說，溫度是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的主要脅迫因子，長期的進化過程中魚類已衍化出抵御溫度應激的生理調(diào)節(jié)機制。綜上所述，機體可能會通過表觀遺傳修飾方式的變化以適應溫度應激，通過進一步研究溫度脅迫對魚類表觀遺傳的影響，有助于尋找與環(huán)境適應力相關的重要基因標志物，從而解釋表觀遺傳的作用機理，為表觀遺傳學在魚類抗逆育種及其抗脅迫中的應用提供新的思路和理論參考。2.1.2 光照 在自然界，所有生物的能量均來源于光照，光的變化具有穩(wěn)定性和規(guī)律性，光的周期性變化可影響魚類的繁殖、代謝等生理機能。已有研究表明，光的周期性變化可通過表觀遺傳影響魚類的表型。干旱期間，低耗能狀態(tài)和極端溫度下穴居的有條紋青蛙骨骼肌基因的轉錄沉默，DNA甲基轉移酶和DNA甲基化顯著擴增。夏眠成年蛙DNA甲基轉移酶DNMT1的轉錄水平和轉錄協(xié)同抑制因子SIN3A顯著高于非成年蛙。與此類似，光周期性變化通過DNA甲基化調(diào)節(jié)肌肉生長速率的機制在大西洋鱈魚Gadus morhus中也有報道，連續(xù)暴露在光照下的大西洋鱈肌肉中DNMT1和DNMT3A基因的表達量顯著高于自然光周期下飼養(yǎng)的魚。這種現(xiàn)象會一直維持下去，直到自然光周期等于連續(xù)照明的光周期，這表明，飼養(yǎng)期間連續(xù)的光照對于DNMT基因的表達影響可能是持久的[60]。目前，光照對魚類表觀遺傳具體作用機制還有待進一步研究。

2.2 主要化學脅迫對水產(chǎn)動物的表觀遺傳效應

2.2.1 有機污染物 在集約化的高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，環(huán)境污染物的存在是不可避免的。已有研究表明，多數(shù)環(huán)境污染物能通過基因組水平調(diào)控表觀遺傳機制，如調(diào)控基因啟動子甲基化水平和組蛋白修飾等，這在生物生長、發(fā)育過程中具有重要的作用。這種表觀遺傳狀態(tài)的變化可以通過生殖系細胞中的一系列調(diào)控從親本傳遞到生殖細胞，最后引起后代表型的變化。已有大量研究表明，生物生長后期相關基因的疾病是由基因組甲基化狀態(tài)的變化引起。苯菌靈 (Benomy1)處理后的斑馬魚Danio rerio胚胎將會有一半死亡，存活的胚胎也會出現(xiàn)畸形、心臟伸長、脊柱彎曲、心包水腫、心率降低等癥狀[61]。用雌二醇 (E2)處理后的雄性三刺魚性腺基因組會處于高甲基化狀態(tài)[7]。水蚤暴露于烯菌酮中DNA甲基化水平會發(fā)生持續(xù)穩(wěn)定的降低，且這種變化會遺傳給后代[62]。用烯菌酮處理F0代小鼠，可在F3代小鼠的生殖細胞中檢測到DNA甲基化狀態(tài)的改變[63]。暴露17α－炔雌醇一段時間后的成年斑馬魚，其肝臟卵黃蛋白原Ⅰ基因的5′側翼甲基化水平明顯下降，這表明雌激素可通過誘導DNA甲基化水平調(diào)控軟黃蛋白原的表達[64]。暴露于E2或BPA環(huán)境下的小鼠，其前列腺4型磷酸二酯酶變體4酶基因會處于低甲基化狀態(tài)，這表明發(fā)育時期小鼠的前列腺表觀基因組會受到低濃度雌激素的影響[65]。

野生魚在污染水域中性腺增長相關基因的甲基化水平會異常升高，且其性腺增長速度顯著低于在正常水環(huán)境中的野生魚[66]。在阿特拉津和毒死蜱農(nóng)藥脅迫下，鯉Cyprinus carpio的性腺組織和腦甲基化水平也會隨之發(fā)生改變[67]。先前有研究表明，當環(huán)境中的苯并 [a]芘濃度達到1 μg/L時能夠傳代影響F3代青鳉Oryzias latipes幼魚的骨骼發(fā)育，苯并 [a]芘處理后的子三代雄性成魚通過Ct測量和組織病理學分析發(fā)現(xiàn)，骨骼的厚度減少，微裂紋增加，通過比對青鳉魚對照組和處理組miRNA的表達，檢測到5種方式mRNA/miRNA(Osx/Mir－214， Col2a1b/Mir－29b， Runx2/miR－204， Sox9b/miR－199a－3p， Apc/Mir－27b)[68]， 這表明苯并[a]芘能通過miRNA調(diào)節(jié)表觀遺傳機制。有研究表明，Cr(VI)可與組蛋白去乙酰化酶1－DNA甲基化轉移酶1的復合物 (HDAC－DNMTL)相結合，通過交聯(lián)到Cypla1啟動子區(qū)域的染色質(zhì)的方式，抑制由AhR調(diào)節(jié)的基因轉錄，引起組蛋白H3甲基化、磷酸化等，從而促進了B[a]P和DNA形成加合物，導致DNA損傷[69](圖3)。有機污染物對魚類表觀遺傳影響的數(shù)據(jù)越來越多，并引起廣大學者的重視，更多的作用機制還有待進一步研究。2.2.2 重金屬 環(huán)境中的重金屬，如鎘、鎳、鉻和甲基汞等可以引起機體發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生大量氧自由基，可氧化損傷DNA，干擾DNMTs與DNA的相互作用，從而影響DNA甲基化狀態(tài)[70]。有研究表明，毛蚶Scapharca subcrenata在經(jīng)過Cd2＋和Cu2＋處理之后，鰓組織甲基化水平異常升高[71]。也有研究顯示，在經(jīng)砷暴露數(shù)周后的大鼠Rattus norvegicus肝臟全基因組DNA呈低甲基化狀態(tài)[72?。同樣，當金魚Carassius auratus經(jīng)砷暴露數(shù)周后，肝臟全基因組呈高甲基化狀態(tài)[73]。周新文等[74]研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚Carassius auratus在經(jīng)0.02 mg/L的Pb2＋染毒48 h后，腎臟和肝臟中DNA總甲基化顯著提高。王丙蓮等[75]研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍 Misgurnus anguillicaudatus在經(jīng) Pb2＋染毒 14 d后，肝胰臟DNA甲基化水平明顯升高，但在染毒28 d后，腎臟DNA甲基化水平異常降低。將圍產(chǎn)期大鼠經(jīng)飲水暴露乙酸鉛2個月后發(fā)現(xiàn)，新生小鼠海馬體全基因組呈高甲基化狀態(tài)[76]。在用鎘對歐洲鰻魚Anguilla anguilla的慢性脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)，相關基因通過甲基化水平的變化對基因表達產(chǎn)生負調(diào)控[77]。通過研究重金屬對水生動物表觀遺傳效應的影響，闡明相關的作用機制，可為重金屬污染防治提供一些參考依據(jù)。

2.2.3 鹽度 鹽度對于水生動物在淡水湖泊、河流和海洋間的遷移是十分重要的。洄游魚類必須通過調(diào)節(jié)基因的表達途徑，以適應從出生地到進入海洋 (或從海洋返回產(chǎn)卵場)間不斷變化的鹽度。從孵化場遷往海洋的魚存活率往往較低，這可能與適應孵化環(huán)境有關。在對鮭魚Oncorhynchus的研究中發(fā)現(xiàn)，不同生長條件的體質(zhì)下降現(xiàn)象與基因組的甲基化有關[78]，但是這種變化在淡水孵化場養(yǎng)殖的魚中未被發(fā)現(xiàn)[79]。在對三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的低鹽脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)，其鰓中有12個差異表達的mRNA，這些mRNA的靶基因主要參與甲殼素的代謝及離子轉運等滲透壓的調(diào)節(jié)過程[80]。滲透脅迫轉錄因子1(Osmotic Stress Transcription Factor 1，OSTF1)在水生動物的滲透壓調(diào)節(jié)過程中起著重要作用。Yan等[81]研究發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚miR－429可通過調(diào)控OSTF1的表達來調(diào)控血漿中的離子濃度。Flynt等[82]研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚Danio rerio的胚胎發(fā)育過程中，miR－8家族可通過調(diào)節(jié)Nherf1基因的表達來調(diào)控離子的轉運，并且在離子細胞中高度表達。

圖1 組蛋白修飾[24]Fig.1 Histone tail modifications[24]

圖2 非編碼RNA的調(diào)控機制[49]Fig.2 Regulation of gene transcription by non－coding RNAs[49]

圖3 B[a]P通過與DNA共價形成DNA加合物導致基因損傷[71]Fig.3 B[a]P can cause gene damage by covalent binding of DNA adducts with DNA[71]

一些廣鹽性的水生動物如凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei、羅非魚、梭魚Mugil soiuy等在淡水和海水中均可進行人工養(yǎng)殖，目前對其滲透壓的調(diào)節(jié)機制尚不明確，從上述研究結果來看，鹽度的變化能影響水生動物的一些miRNA及其相關基因的表達。針對具體物種的滲透壓調(diào)節(jié)機制，分析養(yǎng)殖水體環(huán)境的水質(zhì)、離子等成分可在必要時補充相關離子，對水生動物的生長具有重要的意義。因此，研究鹽度對水產(chǎn)動物的表觀遺傳調(diào)控機制顯得尤為重要，相關內(nèi)容還待進一步地解析。

2.2.4 亞硝酸鹽、氨氮 亞硝酸鹽和氨氮是普遍存在于水環(huán)境中的污染物，亞硝酸鹽由細菌消化過程和反硝化過程產(chǎn)生，氨氮是水產(chǎn)動物蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物。當水體中的亞硝酸鹽和氨氮濃度過高時，會降低水產(chǎn)動物的生長率、免疫力，并造成其生理功能紊亂，甚至導致死亡。Guo等[83]對凡納濱對蝦的研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽暴露顯著上調(diào)caspase－3 mRNA水平，同時誘導血細胞凋亡。Sun等[84]對團頭魴的研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽暴露誘導鰓細胞凋亡，并伴隨著caspase－8和caspase－9 mRNA的上調(diào)。腫瘤抑制因子P53參與多種生物學過程，包括DNA損傷修復，在對暗紋東方鲀Takifugu obscurus的研究中發(fā)現(xiàn)，在氨氮應激下，機體會通過誘導NO和ROS的產(chǎn)生并上調(diào)P53的表達量來對抗應激帶來的損傷[85]。目前，關于亞硝酸鹽、氨氮對水產(chǎn)動物的表觀遺傳機制的影響研究較少，但根據(jù)表觀遺傳的作用機制可以分析發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾可影響多種生物學過程，包括DNA的損傷修復，誘導相關抗氧化基因的上調(diào)，從而抵抗外界環(huán)境脅迫對水產(chǎn)動物機體造成的損傷。開展此方面的研究有助于了解亞硝酸鹽、氨氮對水生動物表觀遺傳修飾的作用規(guī)律，為揭示水產(chǎn)動物氧化應激調(diào)節(jié)機制具有重要意義。

2.3 主要生物應激對水生動物的表觀遺傳效應

2.3.1 營養(yǎng)素 許多營養(yǎng)刺激可以通過改變特定細胞的表觀遺傳標記，影響魚類發(fā)育過程中細胞的分化，目前，營養(yǎng)與表觀遺傳學的研究也受到廣大學者的關注。虹鱒Oncorhynchus mykiss的幼體發(fā)育需要經(jīng)歷內(nèi)源性營養(yǎng)、混合營養(yǎng)和外源性營養(yǎng)3個階段，有研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒肌肉中miR－1/133在這3個階段中特異表達，且表達量逐漸下降，這表明隨著魚類的食性變化，miR－1/133會通過調(diào)控肌細胞的形成參與魚類的生長過程[86]。對禁食和飽食后的鱖Siniperca chuatsi研究發(fā)現(xiàn)，miR－10c等7個miRNA在肌肉中差異表達，這表明食物攝取能通過miRNA調(diào)控骨骼肌的發(fā)育[87]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高碳水化合物飼料能使虹鱒患有糖尿病，通過檢測mRNA轉錄水平發(fā)現(xiàn)，H3K9處于低乙酰化狀態(tài)、G6pcb2處于高甲基化狀態(tài)[88]。缺乏維生素(A、D、C)的鱸魚其生長因子相關基因表達的時序和協(xié)調(diào)性會受到破壞，影響成骨細胞的分化，從而使某些細胞轉化成脂肪細胞，導致魚體畸形[88]。成骨細胞轉化成脂肪細胞也可以發(fā)生在海洋魚類早期生命階段膳食中不飽和脂肪酸較高的情況下[89]。鮭魚脂肪前體細胞具有根據(jù)環(huán)境條件分化免疫譜系細胞 (最有可能是類巨噬細胞)的能力[90]。目前，日糧蛋白質(zhì)缺乏對機體表觀遺傳影響的報道相對較多，Rees等[91]研究發(fā)現(xiàn)，給妊娠期小鼠飼喂低蛋白質(zhì)的日糧會導致子代肝臟組織DNA高度甲基化，這也是動物胚胎時期營養(yǎng)缺乏與子代表觀遺傳修飾變化關系的較早報道。有諸多試驗表明，在動物妊娠期間，日糧蛋白質(zhì)缺乏會導致子代DNA某些核心區(qū)域甲基化模式發(fā)生改變，且這種變化在動物成年后會變得非常穩(wěn)定?？偟膩碚f，現(xiàn)有研究表明，母體蛋白質(zhì)缺乏會通過表觀遺傳修飾的方式影響子代基因的表達。Burdge等[92]研究表明，脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪酸 (n－3 HUFA's)可以改變表觀基因組。n－3 HUFA是類花生酸類的重要前體物質(zhì)，對魚類的生長和發(fā)育至關重要，其以ATP的形式為魚類代謝提供能量，且參與細胞膜的形成[93]。雌性鮭魚性腺發(fā)育過程中，日糧中的脂肪源發(fā)生改變，會影響魚卵的脂肪酸成分，結果導致胚胎發(fā)育異常[94]。增加真鯛Pagrosomus major親魚日糧中的魚油添加比例，會影響孵化3 d后仔魚的存活率、魚苗的長度，卵的直徑，以及蛋白質(zhì)和脂肪含量，并影響脂肪細胞的代謝和形態(tài)[95－96]。對人類的研究表明，妊娠期α－亞麻酸的攝取會誘發(fā)后代肝臟出現(xiàn)表觀遺傳學變異[97]。Benatti等[98]研究發(fā)現(xiàn)，一些脂肪酸會作為激素控制轉錄因子的活性。Seierstad等[99]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂不同脂肪源的大西洋鮭Salmo salar長至3～5 kg時，就已經(jīng)出現(xiàn)與典型生活方式相關的癥狀，如動脈硬化、肝臟和心臟等器官中的脂肪異常沉積，導致魚類器官功能受損和各種循環(huán)問題。

日糧營養(yǎng)與有機體的關系一直是學者重點研究的方向，有關日糧營養(yǎng)素對動物DNA甲基化的影響已有較多的研究，甲基供體對DNA甲基化的調(diào)控也受到了較多關注，如甜菜堿對肉雞脂蛋白酯酶(LPL)[100]和脂肪合成酶 (FAS)[101]啟動子甲基化的影響。研究營養(yǎng)素對水產(chǎn)動物表觀遺傳影響的分子機制，有助于從源頭上闡述營養(yǎng)素對魚類的影響，但目前營養(yǎng)素對魚類表觀遺傳調(diào)控的影響研究剛剛起步，隨著研究的逐步深入，其中的具體調(diào)控機制將會逐步明確。

2.3.2 雌、雄個體 有研究表明，雌魚哺育后代能通過表觀遺傳影響后代，通過對三刺魚Gasterosteus aculeatus的研究，雄魚哺育后代同樣能增加后代對早期環(huán)境壓力的抗性，提高后代成活率，而這種變化與腦組織中DNA甲基化密切相關[102]。歐洲鱸魚的雄魚相比于雌魚芳香化酶啟動子表現(xiàn)出較高水平的DNA甲基化[103]。類似的研究在兩棲類動物紅耳龜Trachemys scripta和密西西比短吻鱷Alligator mississippiensis中也有報道[104]。一些種類的海龜 Chelonia mydas、蜥蜴和鱷魚 Crocodylus siamensis的性別會受到溫度的影響，在對鱷魚的研究中發(fā)現(xiàn)，雄性性腺的SOX9基因的啟動子序列基因相比于雌性表現(xiàn)出較高的DNA甲基化水平[105]。在遺傳育種方面，紅鯽與鯉的異源四倍體雜交過程同樣被證實受到DNA甲基化調(diào)控[106]。研究表明，CYP11a1基因在卵巢和精巢發(fā)育過程中的表達規(guī)律不同，在精巢成熟期表達量最高，CYP11a1基因在一定程度上與斑馬魚的性腺發(fā)育相關，其可能在促進斑馬魚精子成熟中發(fā)揮一定作用[107]。不同種魚類有不同的生活習性及生長特性，通過研究其與表觀遺傳的作用機制，對于理解表觀遺傳機制的多功能性和解析水產(chǎn)動物生長特性均具有重要意義。

2.3.3 養(yǎng)殖密度 在集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖中，養(yǎng)殖密度的提高可有效增加養(yǎng)殖效益，但隨著養(yǎng)殖密度的提高，魚類也受到了更多的生存壓力。Sadhu等[108]研究發(fā)現(xiàn)，海鱸Lateolabrax japonicus血糖含量在高密度組顯著高于低密度組，Xie等[109]研究發(fā)現(xiàn)，鯉的血液皮質(zhì)醇、葡萄糖、溶菌酶和肝丙二醛含量在擁擠脅迫后顯著升高，肝臟中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性在擁擠脅迫后減少。Costas等[110]研究發(fā)現(xiàn)，塞內(nèi)加爾舌鰨Solea senegalensis養(yǎng)殖63 d后，高密度組中魚血漿滲透壓顯著提高，這表明過高的養(yǎng)殖密度會導致機體滲透壓功能和離子平衡的改變。Caipang等[111]研究表明，大西洋鱈在擁擠脅迫24 h和72 h后，HSP70基因表達顯著上調(diào)。在對養(yǎng)殖密度的研究中發(fā)現(xiàn)，高密度組的海鱸和虹鱒HSP70基因表達顯著高于低密度組[112－113]。而對塞內(nèi)加爾鰨的研究中，高密度組魚HSP70和HSP90基因的表達顯著下調(diào)[114]。Gornati等[112]研究發(fā)現(xiàn)，海鱸 MT mRNA水平在高密度養(yǎng)殖條件下顯著上調(diào)，表明MT可作為一種應激指標來評估機體的生理狀態(tài)。CYP1A是混合功能氧化酶，可作生物標志物，用來評估機體生理狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，海鱸肝、脾和腎CYP1A基因在高密度養(yǎng)殖條件下均顯著上調(diào)[112]。促性腺激素釋放激素GnRH1是一種十肽結構的神經(jīng)激素，具有刺激腺垂體釋放促性腺激素 (FSH)和黃體生成素 (LH)釋放的功能，控制著脊椎動物的繁殖[115]。在對非洲慈鯛的研究中發(fā)現(xiàn)，妊娠期雌魚正常生長情況下和擁擠脅迫條件下腦組織中GnRH1基因甲基化程度在一些CG位點明顯不同，且其后代中CpG島－1146、－1128和－1110位點呈低甲基化狀態(tài)[116]。在對虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，高密度能顯著提高其鰓和腎臟中PYGMA基因的表達，使肝臟中HIF1A信號通路上調(diào)，且與擁擠脅迫下血糖濃度的變化相一致[117]。從以上結果可以發(fā)現(xiàn)，擁擠脅迫可以影響魚的生長，以及代謝酶和基因的表達。雖然某些基因變化的具體調(diào)節(jié)機制尚不明確，但可以明確的是，基因表達水平的變化是通過外界環(huán)境刺激誘導表觀遺傳修飾，進而影響基因的表達。目前，密度應激與酶及應激相關信號通路 (如Nrf2－Keap1)的關系已有報道，但與表觀遺傳變化的具體調(diào)節(jié)機制還有待研究。

2.4 人為應激的表觀遺傳效應

管理脅迫是指在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中由于人為管理操作而對水產(chǎn)動物所造成的脅迫。高強度的管理脅迫會對養(yǎng)殖動物的生理狀態(tài)、繁殖、免疫力和生長造成不利影響。如在拉網(wǎng)、分池、捕捉、苗種運輸、麻醉、消毒、病害用藥等。生物前期生活經(jīng)歷的環(huán)境效應和前期母體效應將會影響各種精神機能的發(fā)育。對大鼠的研究表明，母體效應的變化信息能夠穩(wěn)定的影響后代DNA甲基化[118]。研究發(fā)現(xiàn)，親代長期受到電離輻射會通過生殖細胞將輻射危害信息傳遞給下一代，增加癌癥發(fā)病率和突變的可能性。研究人員推測，這可能是環(huán)境中的電離輻射會影響機體基因組DNA甲基化水平，且該影響具有相對穩(wěn)定的遺傳特性[118]。對表觀遺傳機制與人為應激的研究較少，許多具體機制有待進一步研究。

綜上所述，表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控等4個方面。這4個方面既相互作用又相互獨立，共同調(diào)節(jié)著胚胎期及出生后整個生命周期中的基因表達。DNA甲基化是表觀遺傳修飾最主要的方式，近些年，在對哺乳動物的研究中已獲得了較多數(shù)據(jù)支持，對水生生物的研究結果表明，有較多的應激方式均可引起DNA甲基化的變化，如高溫可誘導鱸魚CYP19A啟動子和刺參相關促甲基化酶的表達，光照、營養(yǎng)成分、水環(huán)境變化等均會影響相關基因的甲基化程度。污染物B[a]P可引起組蛋白H3甲基化、磷酸化等，從而促進了B[a]P和DNA形成加合物，影響基因的表達。目前，關于非編碼RNA對水生動物表觀遺傳效應的影響研究已有較多的報道，亞硝酸鹽、氨氮、鹽度的變化等均會引起相關非編碼RNA的變化?？傊?，水生動物在生長過程中會受到物理、化學、生物、人為等應激因素影響，并通過DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控等的表觀遺傳調(diào)控，最終影響水生動物的生長，以及發(fā)育障礙、疾病等表型性狀 (圖4)。

4 展望

外界環(huán)境刺激會影響動物生長發(fā)育，引起表現(xiàn)型發(fā)生改變，其未涉及遺傳信息的改變，這屬于表觀遺傳學的范疇。在宏觀上，生物體通過表現(xiàn)型的變化適應生活環(huán)境的改變，在分子水平上，環(huán)境脅迫和表觀遺傳間的關系還有待深入研究。近年來，隨著蛋白質(zhì)組學技術和基因組測序技術的快速發(fā)展，研究基因調(diào)控和基因功能與環(huán)境應激的關系已經(jīng)成為可能，如運用二代測序技術可系統(tǒng)檢測水生動物的基因組及轉錄組，但研究表觀基因組需要考慮的因素也許多，如研究處于什么發(fā)展階段的表觀基因組，判斷這些表觀遺傳變化是否遺傳就必須研究親本和子代早期生活階段的表觀基因組。在某些情況下，在魚的發(fā)育過程中進行表觀遺傳標記是必要的。通過對表觀遺傳機理的深入研究，能讓養(yǎng)殖工作者更多地了解環(huán)境因素對魚類健康的影響，從而針對不同生長階段的水產(chǎn)動物，設計更精細、更合理的養(yǎng)殖環(huán)境，使魚類的生產(chǎn)性能得到更大程度發(fā)揮的同時減少魚類患病幾率，提高經(jīng)濟效益，同時為育種學家提供新的思路，如尋找鑒定新的miRNA，并對靶基因進行標識，實現(xiàn)對水產(chǎn)動物的組織定向分化?；?qū)NA甲基化用作分子遺傳標記手段對目標性狀進行輔助選擇標記，調(diào)控特異性基因?qū)崿F(xiàn)對性別的控制，從而改善水產(chǎn)動物品質(zhì)，加快推動集約化高效養(yǎng)殖的現(xiàn)代化漁業(yè)進程。

圖4 表觀遺傳調(diào)節(jié)機制Fig.4 Epigenetic regulation mechanisms

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