袁亞芳 潘稚芬

[摘要] 目的 了解嘉興一院2016～2017年結(jié)核分枝桿菌耐藥狀況，并利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究其可能存在的耐藥機制，為耐藥結(jié)核病的防控策略提供科學(xué)依據(jù)。 方法 對2016年1月～2017年6月嘉興一院746株結(jié)核分枝桿菌進行培養(yǎng)及藥敏試驗分析，采用雙向電泳技術(shù)比較臨床不同耐藥菌株與敏感菌株的全菌蛋白表達圖譜，利用基質(zhì)輔助激光解吸及電離飛行時間質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因進行序列分析。 結(jié)果 746株結(jié)核分枝桿菌中總耐藥率為18.50%（138/746），單耐藥率為9.92%（74/746），耐多藥率為4.42%（33/746），多耐藥率為4.16%（31/746）。4種藥物的耐藥率由高到底依次為異煙肼（INH，11.53%，86/746）、鏈霉素（Sm，10.86%，81/746）、利福平（RFP，5.36%，40/746）、乙胺丁醇（EMB，4.29%，32/746）。初治耐藥率及復(fù)治耐藥率分別為17.22%（115/668）、29.49%（23/78），復(fù)治耐藥率高于初治（χ2=6.976，P<0.01）；從蛋白質(zhì)組學(xué)功能分析結(jié)核分枝桿菌可能存在的耐藥機制，發(fā)現(xiàn)了21個耐藥結(jié)核桿菌的差異表達蛋白，其中5個蛋白的檢出率在耐藥菌株中相對較高，質(zhì)譜分析獲得明確的肽質(zhì)量指紋圖譜，分別為Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c。 結(jié)論 嘉興一院近2年結(jié)核分枝桿菌耐藥率保持在較低水平，且發(fā)現(xiàn)Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c與其耐藥機制密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；耐藥譜；比較蛋白質(zhì)組學(xué)；耐藥機制

[中圖分類號] R52 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）07-0071-05

[Abstract] Objective To investigate the status of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis（Mtb） and drug resistance related proteins， providing the basis for drug-resistant MTB prevention and control. Methods A total of 746 Mtb strains between January 2016 and June 2017 were cultured and anti-tuber-colosis drug susceptibility tests， the drug resistance of 4 kinds of anti-tuberculosis drugs was analyzed. The proteins extracted from different clinical drug resistant Mtb strains and susceptible Mtb strains were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Protein spots remarkly increased in different clinical drug resistant Mtb strains were digested in gel by enzyme and the mass of generated peptides were measured by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALdI-TOF-MS）. The date obtained from peptide mass fingerprinting were used in protein database search. These genes of all strains were sequenced. Results The total resistance rate was 18.50%（138/746）， multi-drug-resistant rate was 4.42%（33/746）， mono-drug-resistant rate was 9.92%（74/746）， poly-drug-resistant rate was 4.16%（31/746）. Drug resistance rates ranked from high to low as isoniazid（INH， 11.53%，86/746）， streptomycin（Sm， 10.86%，81/746）， rifampicin（RFP， 5.36%，40/746）， ethambutol（EMB， 4.29%， 32/746）. nitial drug resistance rate and acquired drug resistance rate was 17.22%（115/668） and 29.49%（23/78） respectively， and acquired drug resistance rate was higher than the initial drug resistance rate，there was a statistically significant difference（χ2=6.976，P<0.01）. In all protein spot differences， 5 protein spots were upregulated inisoniazid-resistant strains and identified as Rv0444c， Rv1446c， Rv3146， Rv3002c and Rv2159c by （MALdI-TOF-MS）. Conclusion Mycobacterium tuberculosis resistant rate remains at low levels in the First Hospital of Jiaxing nearly two years.5 protein spots（Rv0444c， Rv1446c， Rv3146， Rv3002c and Rv2159c） might be associated with drug resistance mechanism.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Drug-resistant spectrum； Comparative proteomics； Drug resistance mechanism

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的一種慢性傳染病。我國是世界上22個結(jié)核病高負擔(dān)國家之一，耐藥結(jié)核病的傳播流行是目前我國結(jié)核病疫情居高不下的重要原因，其出現(xiàn)和蔓延，嚴重阻礙了我國結(jié)核病防治工作的進程，已成為嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題。

現(xiàn)有的結(jié)核診療技術(shù)已經(jīng)無法應(yīng)對國內(nèi)外日益嚴峻的結(jié)核病疫情，圍繞這一疾病的預(yù)防、早期診斷和治療等全面開展研究，據(jù)此推動結(jié)核分枝桿菌免疫、致病、耐藥機制等基礎(chǔ)研究的前進步伐，不僅是結(jié)防工作者的共識，也是中國作為世界耐藥結(jié)核“特別引起警示的國家和地區(qū)”的現(xiàn)實需求，在這種情況下，分析本院2016～2017年結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況，應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)了解結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及空間差異、相互作用與聯(lián)系，進一步闡述耐藥分子機制顯得尤為必要。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 調(diào)查對象 選擇2016年1月～2017年6月嘉興市第一醫(yī)院痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患者746例?；颊呋厩闆r見表1。

1.1.2 菌株來源 培養(yǎng)陽性的菌株均在嘉興市第一醫(yī)院結(jié)核病實驗室統(tǒng)一做藥敏試驗，選擇其中經(jīng)藥敏試驗鑒定的單耐異煙肼菌株（3株）、單耐利福平菌株（3株）和耐多藥菌株（4株）（其中包括異煙肼+利福平、異煙肼+利福平+乙胺丁醇、異煙肼+利福平+鏈霉素、異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇）；結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準菌株H37Rv（由國家參比實驗室提供）。

1.1.3 主要儀器 PowerPac 3000電泳儀，PROTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀，PROTEAN Ⅱ Xi Cell垂直板電泳儀，Molecular Image Fx凝膠圖像掃描儀，PDQuest6.0圖像分析軟件，均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。U-3000分光光度計為HITACHI公司產(chǎn)品，質(zhì)譜分析系統(tǒng)為美國Applied Biosystems公司的Voyager System 6192基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）。

1.2 方法

1.2.1 臨床耐藥結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗 （1）746株痰培養(yǎng)陽性的結(jié)核分枝桿菌均選擇異煙肼（0.l mg/L）、利福平（1.0 mg/L）、鏈霉素（1.0 mg/L）和乙胺丁醇（5.0 mg/L）4種常用抗結(jié)核藥物進行體外藥物敏感試驗，采用《耐藥檢測指南》推薦的比例法，計算耐藥百分比。（2）耐藥分類：單耐藥：結(jié)核分枝桿菌對一種抗結(jié)核藥物耐藥。多耐藥：結(jié)核分枝桿菌對一種以上的抗結(jié)核藥物耐藥，但不同時包括異煙肼、利福平。耐多藥：結(jié)核分枝桿菌對一種以上的抗結(jié)核藥物至少同時包括異煙肼、利福平耐藥。（3）藥敏試驗均采用已知參考標(biāo)準的結(jié)核敏感株（H37Rv）作為質(zhì)量控制對照。

1.2.2 臨床耐藥結(jié)核分枝桿菌的細菌學(xué)實驗 利用掃描電鏡、透射電鏡分析泛耐藥菌株細胞形態(tài)、細胞壁形態(tài)變化

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及蛋白質(zhì)組分分離 將菌株接種到添加了10%ADC（0.5%牛血清白蛋白，0.2%葡萄糖，140 mmol/L NaCl）和0.5%甘油的Middlebrook 7H9中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)15～20 d，菌體濃度為1×108～2×108或光密度（OD600）為0.8～1.0收取菌體。80℃水浴加熱0.5 h以殺死細菌。超聲破壁，獲得細胞組份蛋白。

1.2.4 利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析耐藥結(jié)核分枝桿菌的差異表達蛋白 應(yīng)用生物信息學(xué)理論和技術(shù)，綜合分析獲得的若干耐藥結(jié)核桿菌和藥物敏感菌株之間的差異蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)方法—雙向電泳技術(shù)（2D-Electrophoresis）：第一向：固相pH梯度等電聚焦凝膠電泳（用自制的電泳上樣緩沖液，17 cm的膠條，pH 4～7、3～10）。采用被動水化，低電壓膠內(nèi)泡脹法。聚焦結(jié)束后，立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳。第二向：聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。配制12%的聚丙烯酰胺凝膠，將IPG膠條面朝上放在凝膠的長玻璃板上。起始時用低電流（5 mA/gel/17 cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（20～30 mA/gel/17 cm），溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。取出凝膠，并切角以作記號。

1.2.5 肽指紋圖譜鑒定與分析 蛋白凝膠銀染后，凝膠用Molecular Image Fx激光圖像掃描儀掃描，配比分析采用PDQuest 6.0軟件完成。

篩選差異蛋白質(zhì)斑點，加適量消化液（50 mmol/L NH4HCO3，5 mmol/L CaCl2，12.5 ng/μL Trypsin）消化，抽干，加0.5%TFA溶解。MALDI-TOF-MS肽指紋圖譜分析并鑒定PepIdent（www.expasy.org/tools/peptident.pl）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。計量資料用（x±s）表示，計數(shù)資料以描述性統(tǒng)計分析，對耐藥率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基本情況

746株結(jié)核分枝桿菌中，608例對4種抗結(jié)核藥物全部敏感，占81.50%，138例患者耐藥，總體耐藥率為18.50%；其中單耐藥74例，單耐藥率為9.92%；耐多藥33例，耐多藥率為4.42%；多耐藥31例，多耐藥率為4.16%。4種藥物的耐藥率由高到底依次為H 11.53%（86/746）、S 10.86%（81/746）、R 5.36%（40/746）、E 4.29%（32/746）。見表2。

2.2 耐藥譜分析

四種藥物均有單耐藥情況發(fā)生；耐多藥有四種組合：HR、HRS、HRE、HRSE；多耐藥有五種組合：HS、HE、RS、SE、HSE。單耐藥以耐S最多，耐多藥以耐HRSE最多，其次是HR，多耐藥以耐HS最多。初治患者耐藥順位為S（10.78%，72/668）、H（10.03%，67/668）、R（14.07%，27/668）、E（3.89%，26/668），復(fù)治患者耐藥順位為H（24.36%，19/78）、R（16.67%，13/78）、S（11.54%，9/78）、E（7.69%，7/78）。見表3。

2.3 初復(fù)治患者耐藥情況分析

初治患者668例中耐藥115例，初治總耐藥率為17.22%；耐多藥21例，初治耐多藥率為3.14%。復(fù)治患者78例中耐藥23例，復(fù)治總耐藥率為29.49%；耐多藥12例，復(fù)治耐多藥率為15.38%。復(fù)治總耐藥率高于初治總耐藥率（χ2=6.976，P<0.01），復(fù)治耐多藥率高于初治耐多藥率（χ2=24.753，P<0.01）。

2.4 耐藥結(jié)核分枝桿菌的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果

運用PDQuest6.0圖像分析軟件對臨床不同耐藥模式菌株、全敏菌株及H37Rv菌株進行分析，共發(fā)現(xiàn)21個差異表達蛋白點，經(jīng)切割消化后，進行MALDI-TOF-MS檢測，并根據(jù)試驗方法中敘述的數(shù)據(jù)庫搜索方法對這些差異點進行鑒定（表4）。其中5個蛋白的檢出率在耐藥菌株中相對較高、質(zhì)譜分析獲得明確的肽質(zhì)量指紋圖譜，分別為Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c（封三圖2、圖3，表5）。

3 討論

本研究746株結(jié)核分枝桿菌中，總耐藥率為18.50%（138/746），耐多藥率為4.42%（33/746），其中初治耐藥率和復(fù)治耐藥率分別為17.22%（115/668）、29.49%（23/78），初治耐多藥率和復(fù)治耐多藥率分別為3.14%（21/668）、15.38%（12/78），耐單藥順位從高到低依次為INH（11.53%）、Sm（10.86%）、RFP（5.36%）、EMB（4.29%），與2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果相比（總耐藥率為36.8%，初治耐藥率為36.9%，復(fù)治耐藥率35.9%，總耐多藥率6.8%，初治耐多藥率為5.4%，復(fù)治耐多藥率為15.4%，耐藥順位為INH 28.6%、Sm 19.6%、RFP 8.9%、EMB 6.8%），耐藥率略低于全國流調(diào)水平[1]。單耐藥率為9.92%（74/746），耐多藥率為4.42%（33/746），低于潘稚芬等[2]報道的嘉興一院2004～2010年耐藥監(jiān)測結(jié)果（單耐藥率為17.28%，耐多藥率為27.84%）。究其原因是由于嘉興市第一醫(yī)院自2013年以來開展了全球基金耐多藥防控策略，其中包括所有涂陽肺結(jié)核患者早期結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)，GeneXpert、基因芯片等快速分子生物學(xué)檢測技術(shù)的應(yīng)用；確診的耐藥肺結(jié)核患者均給予免費治療，每一例患者治療方案均由市級專家組討論決定，根據(jù)患者實際病情，使用標(biāo)準及個體化相結(jié)合的耐藥結(jié)核治療方案，劑量根據(jù)藥代動力學(xué)特征計算，嚴格執(zhí)行2個月住院治療（靜脈用藥），6個月強化期（注射）治療，18個月鞏固期治療；輔以醫(yī)務(wù)人員全程督導(dǎo)，并適當(dāng)給予患者營養(yǎng)及交通補助，提高服藥的依從性，以上措施使肺結(jié)核的治愈率達到85%以上，耐多藥肺結(jié)核的治愈率也達到70%以上，本研究結(jié)果說明近四年嘉興一院耐多藥肺結(jié)核病防控策略取得了一定的成效。

利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析耐藥結(jié)核分枝桿菌的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)差異表達的21個蛋白質(zhì)點中，新增2個、缺失6個、8個上調(diào)表達、2個下調(diào)表達、3個異常表達。這些差異蛋白主要為中間代謝/呼吸作用蛋白、調(diào)節(jié)蛋白、細胞壁和細胞外排系統(tǒng)和PE/PPE成員相關(guān)蛋白及保守假定蛋白。質(zhì)譜分析后獲得5個明確的肽質(zhì)量指紋圖譜，分別為Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c。

Rv2629c編碼的是一種保守假定蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白是結(jié)核分枝桿菌進入潛伏生長狀態(tài)高表達標(biāo)志蛋白，存在于細胞膜和細胞壁，與利福平耐藥機制密切相關(guān)。耐藥菌可以通過降低生活能力，進入潛伏狀態(tài)來抵抗外界的不良環(huán)境，或以這種進入潛伏狀態(tài)的方式降低與藥物的作用效率，從而降低或抵抗抗生素對其的殺滅作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)生長72 h后，耐藥株中Rv2629基因上調(diào)明顯。另有動物實驗發(fā)現(xiàn)[4]過表達Rv2629的細菌感染小鼠20 d后，其臟器存活數(shù)多于對照組。而小鼠肺泡結(jié)構(gòu)被炎性浸出物滲透和炎性細胞浸潤，肺泡壁充血增厚，有明顯的肉芽腫形成。以上結(jié)果均說明耐藥菌株中過表達的Rv2629可能提高其存活率和致病性，與其耐藥機制密切相關(guān)。進一步研究[5]發(fā)現(xiàn)Rv2629蛋白可能屬于藥泵體系，該體系最常見的主要是易化超家族（major facilitator superfamily，MFS）和ATP結(jié)合盒家族（ATP-binding cassette，ABC），但具體屬于哪一種類型及其所發(fā)揮的具體機制都需要進一步證據(jù)加以證實。

RshA是由Rv0444c表達的一種SigK操縱子抑制蛋白，該蛋白在臨床耐多藥菌株中表達下調(diào)，說明Rv0444c可能是與耐藥相關(guān)的基因。耐藥結(jié)核桿菌通過RskA的下調(diào)表達，弱化了對SigK的負調(diào)控，導(dǎo)致MPT83抗原蛋白的上調(diào)表達，并通過光鏡發(fā)現(xiàn)Rv0444c的過表達可導(dǎo)致菌落邊緣整齊，折光性增強，細胞壁有增厚趨勢，由此可推測增厚的胞壁減低了抗結(jié)核藥物穿胞殺菌作用[6]，然而實驗發(fā)現(xiàn)MPT83抗原蛋白的上調(diào)表達卻不影響耐藥菌生長。另有研究[7]稱該蛋白還能夠介導(dǎo)細菌對阿米卡星、卷曲霉素耐藥。

Rv1446c編碼的opcA蛋白是一種膜蛋白，其功能可能是磷酸戊糖途徑中輔助葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的一種蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)Rv1446c參與耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌耐藥機制形成[8-10]。目前對該蛋白質(zhì)的深入研究少有報道。Rv2159c編碼的是一種保守假定蛋白，亦屬于結(jié)核分枝桿菌膜蛋白，該蛋白在耐多藥菌株和單耐異煙肼菌株中都呈下降趨勢，可能會導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對宿主的侵襲能力下降[11]。Rv3002c編碼的是乙酰羥酸合成酶小亞基（ilvN），該蛋白存在于支鏈氨基酸代謝途徑，ilvN僅在臨床耐多藥株中新增表達，為耐多藥發(fā)生機制提供線索，并可能成為抗耐多藥結(jié)核的藥物設(shè)計靶標(biāo)和可能的耐藥檢測標(biāo)準[12-13]。Rv3146又叫做NADH-CoQ氧化還原酶B鏈（nuoB），其在雙耐藥菌株的菌體蛋白中表達異常，屬于中間代謝和呼吸作用相關(guān)蛋白[14]。對nuoB蛋白的抗原表位分析發(fā)現(xiàn)，其可在耐多藥結(jié)核患者中激起較高水平的體液免疫反應(yīng)，具有耐藥結(jié)核血清學(xué)鑒別診斷的能力[15]。

綜上所述，嘉興一院結(jié)核病患者總體耐藥率略低于2010年全國流調(diào)水平，這得益于本地區(qū)有效的防控措施，但復(fù)治患者耐藥率、耐多藥率高于初治患者，且初復(fù)治耐藥順位不同，因此，在治療時應(yīng)根據(jù)患者不同類型、藥敏試驗及本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥特點，制定個體化的化療方案[16-17]。另外，應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，找到了臨床不同耐藥菌株和敏感株之間差異表達蛋白，但這些蛋白耐藥機制仍需進一步的實驗證實。上述蛋白是篩選新型藥物和診斷抗原的焦點，本研究為尋找新的藥物靶標(biāo)以及篩選不同臨床耐藥模式菌株診斷抗原提供方向，并為今后本地區(qū)耐藥結(jié)核科學(xué)防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2018-01-04）