張 磊, 宋 鑫, 汪景坤, 宋 光

解放軍第二五二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 保定 071000

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的消化道惡性腫瘤。2015年數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年胃癌的新發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)分別約為40萬(wàn)和30萬(wàn)[1-2]。雖然全球胃癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但我國(guó)的發(fā)病率和死亡率仍居高不下，是威脅我國(guó)人民身體健康和降低生活質(zhì)量的重要原因[3]。隨著胃癌的診斷手段和治療技術(shù)進(jìn)步，除了傳統(tǒng)的手術(shù)治療外，分子靶向治療也逐漸成為胃癌治療的較好選擇。尋找有效的分子靶點(diǎn)一直是胃癌領(lǐng)域及臨床研究的焦點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，果糖-1,6-二磷酸酶1(fructose-1,6-bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1)作為一種新的靶分子逐漸成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。FBP1是FBP單鏈DNA結(jié)合家族中的重要成員，在細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與肝癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1在胃癌組織中低表達(dá)，與胃癌的腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存率有關(guān)，提示其可能在胃癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前，關(guān)于FBP1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用未見報(bào)道。因此，本研究以體外實(shí)驗(yàn)的方式，先觀察FBP1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建FBP1過(guò)表達(dá)細(xì)胞，通過(guò)常用的生物學(xué)方法觀察上調(diào)FBP1表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以期為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞胃癌BGC-823細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2試劑FBP1過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-Flag-FBP1)、空載體陰性對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1)和引物購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG(IgG-HRP)抗體、FBP1多克隆抗體、 c-Myc單克隆抗體、Cyclin D1單克隆抗體和β-actin單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，LipofectamineTM2000、RPMI 1640培養(yǎng)液、 Opti-MEM培養(yǎng)液、青/鏈霉素、MTT試劑、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.3方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：以DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)GES-1細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞及SGC-7901細(xì)胞，均培養(yǎng)于37 ℃、95%濕度和體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中，2 d換液1次。待細(xì)胞幾乎完全鋪滿培養(yǎng)瓶底部時(shí)，以質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞脫落后以完全培養(yǎng)液終止消化。離心后(1 500×g)，棄上清，加入適量的完全培養(yǎng)液，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.3.2 FBP1 mRNA檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。收集生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES-1細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞及SGC-7901細(xì)胞，先以試劑盒提取3種細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以25 ml反應(yīng)體系(上下引物各0.5 μl，cDNA模板 2 μl，Taq酶1 μl，Master Mix 10 μl)，上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(×40)；72 ℃ 7 min。其中，F(xiàn)BP1上游引物：5′-CGCGCACCTCTATGGCATT-3′；下游引物：5′-TTCTTCTGACACGAGAACACAC-3′。β-actin上游引物：5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′；下游引物：5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。各種細(xì)胞均設(shè)3個(gè)平行孔，以內(nèi)參β-actin校正，2-△△CT法計(jì)算各種細(xì)胞中FBP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 FBP1蛋白檢測(cè)：采用Western blotting檢測(cè)FBP1蛋白。收集對(duì)數(shù)期的GES-1細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞，以細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并以BCA法進(jìn)行濃度定量。將5×Loading buffer與提取的總蛋白混勻后，置于沸水浴中加熱3 min，以質(zhì)量濃度為15 g/L的SDS-PAGE蛋白進(jìn)行電泳。其中，每孔加入變性蛋白60 μg，各種細(xì)胞均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。先以80 V電壓分離30 min，再換120 V電壓。電泳結(jié)束后，取出蛋白凝膠，按濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上，以TBST液(含質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉)封閉處理1.5 h后，加入500倍稀釋的一抗(FBP1抗體和β-actin抗體)、2 000倍稀釋的二抗(IgG-HRP)孵育。避光條件下，滴加ECL發(fā)光液顯影曝光，以凝膠成像儀進(jìn)行掃描，Image軟件分析計(jì)算FBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，以50 000/孔的密度平鋪到6孔板上。待細(xì)胞融合度在75%以上時(shí)，按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書操作步驟次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將BGC-823細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)、陰性組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-FBP1質(zhì)粒)。將預(yù)先配制的200 μl Opti-MEM培養(yǎng)液(無(wú)血清)、2.5 μg質(zhì)粒和10 μl LipofectamineTM2000的混合液分別加入陰性組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，充分混勻后，于常溫下反應(yīng)20 min。轉(zhuǎn)染后48 h，將各組細(xì)胞分為兩份，分別以1.3.2和1.3.3中的方法檢測(cè)各組BGC-823細(xì)胞中FBP1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。

1.3.5 細(xì)胞增殖：MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。收集上述轉(zhuǎn)染后48 h的各組BGC-823細(xì)胞，以每孔200 μl接種細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為50 000/ml)至96孔細(xì)胞板上。置于飽和濕度、37 ℃和體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔中加入10 μl MTT溶液，孵育4 h，以酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm處的吸光度(OD值)。其中，每組設(shè)5個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 細(xì)胞凋亡：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染48 h后的1.3.4中的各組BGC-823細(xì)胞，其中每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。先以質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶進(jìn)行消化，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌，離心(1 500×g)，加入500 μl細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中Binding Buffer制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為30 000/ml)。取1 ml細(xì)胞懸液，分別加入體積均為5 μl Annexin V-FITC和PI，充分混勻后，避光處理15 min，再加入200 μl Binding Buffer，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.3.7 Cyclin D1、c-Myc和Cleaved caspase-3蛋白檢測(cè)：采用Western blotting檢測(cè)各蛋白。收集轉(zhuǎn)染48 h后的1.3.4中的各組BGC-823細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)重復(fù)，以裂解液提取總蛋白并定量后，經(jīng)沸水浴變性、電泳、封閉、轉(zhuǎn)印后，加入800倍稀釋的一抗(Cyclin D1抗體、c-Myc抗體、Cleaved caspase-3抗體和β-actin抗體)，4 ℃下過(guò)夜后，經(jīng)TBST洗膜后，加入2 000倍稀釋的二抗，室溫下孵育2 h后，以ECL顯影曝光，Image軟件分析計(jì)算各組BGC-823細(xì)胞中Cyclin D1、c-Myc和Cleaved caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1FBP1在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)與正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞相比，胃癌BGC-823、SGC-7901細(xì)胞中FBP1蛋白及mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，且BGC-823細(xì)胞較SGC-7901細(xì)胞下降更明顯(P<0.05)(見圖1、表1)。

圖1 Western blotting檢測(cè)胃癌細(xì)胞中FBP1蛋白表達(dá)水平Fig 1 The expression level of FBP1 protein in gastric cancer cells detected by Western blotting

表1 FBP1蛋白和mRNA在正常胃黏膜及胃癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量Tab 1 The relative expressions of FBP1 protein and mRNA in normal gastric tissue and gastric cancer cells

注：與GES-1細(xì)胞相比，*P<0.05；與SGC-7901細(xì)胞相比，#P<0.05。

2.2上調(diào)FBP1抑制BGC-823細(xì)胞增殖與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞FBP1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而陰性組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2、圖2)。結(jié)果成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)的BGC-823細(xì)胞。MTT法檢測(cè)3組細(xì)胞中的OD值，結(jié)果如表3所示。轉(zhuǎn)染后24 h，對(duì)照組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h，陰性組與對(duì)照組比較，細(xì)胞的增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組顯著受到抑制(P<0.05)。

圖2 Western blotting檢測(cè)各組BGC-823細(xì)胞中FBP1蛋白的表達(dá)水平Fig 2 The expression level of FBP1 protein in BGC-823 cells of each group detected by Western blotting

表2 各組細(xì)胞中FBP1蛋白及mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab 2 The relative expression of FBP1 protein and mRNA in the cells of each group

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

表3 上調(diào)FBP1表達(dá)對(duì)各組細(xì)胞增殖的影響Tab 3 The effect of up-regulation of FBP1 expression on cell proliferation in each group

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.3上調(diào)FBP1促進(jìn)BGC-823細(xì)胞凋亡與對(duì)照組比較，陰性組細(xì)胞的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(7.06±2.03)%vs(6.89±1.20)%](P>0.05)，但在過(guò)表達(dá)FBP1的實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組顯著升高[(18.32±3.58)%vs(6.89±1.20)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

2.4上調(diào)FBP1抑制CyclinD1、c-Myc蛋白表達(dá)并促進(jìn)Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，陰性組中Cyclin D1、c-Myc和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組中Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖4、表4)。

注：A：對(duì)照組，B：陰性組，C：實(shí)驗(yàn)組。

圖4 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中Cyclin D1、c-Myc、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

BFP1是糖代謝過(guò)程中的一種關(guān)鍵酶，通過(guò)催化1,6-二磷酸果糖水解在糖降解過(guò)程中發(fā)揮抑制作用。另外，F(xiàn)BP1作為一種轉(zhuǎn)錄輔助因子，可直接進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)與缺氧誘導(dǎo)因子相互作用參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程[8]。有研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1在肺癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)，恢復(fù)FBP1表達(dá)不僅抑制葡萄糖攝取和乳酸生產(chǎn)，也會(huì)在體外缺氧條件下抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲，并在體內(nèi)抑制肺癌生長(zhǎng)；肝癌細(xì)胞中，F(xiàn)BP1啟動(dòng)子超甲基化使FBP1表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞凋亡明顯受到抑制，腫瘤生長(zhǎng)加速；同時(shí)，在結(jié)腸上皮HT-29細(xì)胞中降低FBP1表達(dá)后，細(xì)胞周期受到阻滯，細(xì)胞凋亡受到影響，F(xiàn)BP1在結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，有研究[7,12]指出，F(xiàn)BP1在胃癌組織中低表達(dá)，與胃癌的腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存率有關(guān)，F(xiàn)BP1下調(diào)促進(jìn)胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移，并預(yù)示著預(yù)后差。推測(cè)FBP1可能在胃癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前，有關(guān)FBP1在胃癌中的作用未見報(bào)道。因此，本研究先對(duì)比正常胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中FBP1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中FBP1表達(dá)水平顯著降低，且BGC-823細(xì)胞中FBP1下降更明顯。再以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染FBP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，以MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖和凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1過(guò)表達(dá)的BGC-823細(xì)胞增殖能力顯著降低，且細(xì)胞凋亡能力顯著升高。提示低表達(dá)的FBP1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

Cyclin D1是一種G1期的細(xì)胞周期蛋白，主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)控G1/S期，在細(xì)胞增殖和分裂過(guò)程中發(fā)揮著正向調(diào)節(jié)的作用[13]；c-Myc是一種原癌基因，屬M(fèi)yc蛋白家族，正常情況下不表達(dá)或低表達(dá)，當(dāng)受到刺激時(shí)c-Myc基因被激活，編碼的c-Myc蛋白過(guò)表達(dá)，可以與Cyclin D1共同作用調(diào)控細(xì)胞周期G1/S期，加速細(xì)胞增殖[14]；半胱氨酸蛋白酶(caspase)是細(xì)胞凋亡途徑中重要的一組蛋白酶，caspase-3是其中的一員，位于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最下游，正常情況下以非活性的酶原形式存在，一旦受到凋亡信號(hào)的刺激，則聚集成為有催化活性的Cleaved caspase-3，在細(xì)胞凋亡途徑中履行著凋亡執(zhí)行者的功能[15]。Cyclin D1、c-Myc和caspase-3在胃癌組織中的高表達(dá)，與胃癌惡性程度及預(yù)后關(guān)系密切[16-18]。有研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，下調(diào)FBP1基因可增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性、增加c-Myc和MMP7的表達(dá)；同時(shí)，F(xiàn)BP1通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS和促凋亡蛋白cleaved PARP、Cleaved caspase 3和 Bax的表達(dá)水平和下調(diào)抗凋亡蛋白PARP，caspase 3、Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡；在瘦素處理后的乳腺癌BT-474和MDA-MB-231細(xì)胞中，上調(diào)FBP1表達(dá)后，通過(guò)調(diào)控c-Myc和cyclin D1蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡能力[21]。為了探討上調(diào)FBP1抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制，以Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中Cyclin D1、c-Myc、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高。提示上調(diào)FBP1表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控Cyclin D1、c-Myc和Cleaved caspase-3抑制胃癌BGC-823細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上，F(xiàn)BP1在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Cleaved caspase-3蛋白和下調(diào)Cyclin D1、c-Myc蛋白的表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)果豐富了胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，同時(shí)為建立以FBP1為靶點(diǎn)的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

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