丁夢(mèng)云，劉天相，孫宇慧，柴乖強(qiáng)，高 欣，王 軍，王中華，李春蓮

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、廣適的小麥品種是小麥育種工作的總體目標(biāo)。小麥的大部分農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀、適應(yīng)性狀及株型性狀等為多基因控制的數(shù)量性狀，受環(huán)境影響較大。近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展和數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus， QTL)定位方法的不斷改進(jìn)，使得利用分子標(biāo)記技術(shù)和QTL分析方法定位數(shù)量性狀基因、篩選與性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記用于輔助育種成為可能。越來(lái)越多的控制小麥重要農(nóng)藝性狀的QTL被發(fā)現(xiàn)和定位，同時(shí)一些與QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記不斷地被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種[1-3]，從而大大地加快了育種進(jìn)程，提高了育種效率。研究表明，在大多數(shù)作物中，與農(nóng)藝性狀相關(guān)的QTL在染色體上往往成簇分布，即控制不同性狀的QTL存在于同一染色體的某一區(qū)段，從而形成QTL富集區(qū)[4-6]。QTL富集區(qū)的形成原因主要有兩種：一是控制多個(gè)性狀的幾個(gè)基因彼此緊密連鎖形成基因簇；二是單一基因直接或間接影響多個(gè)性狀，即一因多效現(xiàn)象[7-9]。

在前期研究中，本課題組在1BS、2DS、4BS、5AL、6AL和7AL等染色體上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與小麥重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的QTL富集區(qū)，其中位于4BS的Xwmc48至IWA4662標(biāo)記區(qū)間是小麥重要農(nóng)藝性狀的一個(gè)主要的QTL富集區(qū)，區(qū)間長(zhǎng)度為14.7 cM，將其定名為 QC-4BS。與穗粒數(shù)(KNPS)、千粒重(TKW)、株高(PH)、蛋白質(zhì)含量(GPC)、容重(TW)、單粒重和粒寬相關(guān)的7個(gè)主效QTL位于 QC-4BS區(qū)間，解釋的表型變異分別可達(dá)14.5%、14.4%、36.0%、22.0%、29.5%、27.6%和13.4%，其中與PH、KNPS、GPC及TW相關(guān)的QTL在多個(gè)環(huán)境中均可檢測(cè)到，且已確定控制株高的QTL為 Rht1基因[10-12]。因此探明 QC-4BS染色體功能區(qū)段的遺傳效應(yīng)，挖掘其功能基因，揭示其傳遞機(jī)制及基因間的互作效應(yīng)對(duì)于小麥產(chǎn)量及品質(zhì)性狀的選育及遺傳改良具有重要的意義。本研究擬通過(guò)對(duì) QC-4BS的精細(xì)定位，及分析 Rht1基因?qū)π←淧H、KNPS、GPC及TW等性狀的遺傳效應(yīng)，篩選與這些性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，為小麥優(yōu)良基因的挖掘及小麥染色體功能區(qū)段形成機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種及多性狀聚合育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為普通小麥(TriticumaestivumL.)寧7840與Clark雜交獲得的127個(gè)F12代重組自交系(Recombinant inbred line，RIL),由美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)Guihua Bai教授惠贈(zèng)。寧7840為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的硬紅粒小麥品種，每穗粒數(shù)30～35粒，千粒重35 g左右，株高偏高，對(duì)小麥銹病、白粉病及赤霉病均具有抗性，是多抗性育種的重要基礎(chǔ)材料[13]；Clark為美國(guó)普渡大學(xué)育成的軟粒冬小麥品種，長(zhǎng)穗、大粒，具有較好的產(chǎn)量潛力[14]。親本及RIL株系的PH、KNPS、GPC及TW性狀鑒定方法及表型值參見(jiàn)Li等[10-12]研究。

1.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

采用9K InfiniumTMiSelect SNP基因芯片及親本間有差異的SSR標(biāo)記對(duì)RIL群體進(jìn)行分析，共獲得了2 404個(gè)SNP標(biāo)記和366個(gè)SSR標(biāo)記。采用QTL IciMapping 4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，連鎖群的LOD閾值設(shè)為6.0，利用Kosambi作圖函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(cM)，根據(jù)SSR 共識(shí)圖譜[15]及GrainGenes 2.0網(wǎng)站上公布的小麥SNP遺傳圖譜進(jìn)行連鎖群染色體定位。

1.3 QTL分析

基于完備復(fù)合區(qū)間作圖法(ICIM-ADD)，采用QTL IciMapping 4.0軟件對(duì)PH、KNPS、GPC及TW等性狀進(jìn)行QTL分析。在掃描步長(zhǎng)為1.0 cM，α=0.001的水平上，利用置換檢驗(yàn)法(Permutation test)做1 000 次重復(fù)，將第一類(lèi)錯(cuò)誤概率(假陽(yáng)性)限制在5%，估算基因組范圍內(nèi)的LOD閾值，并以此確定QTL在染色體上的位置及數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 QC-4BS區(qū)間的QTL分析

構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜中共有2 709個(gè)標(biāo)記，包括2 403個(gè)SNP標(biāo)記和306個(gè)SSR標(biāo)記定位到了45個(gè)連鎖群中，覆蓋了小麥21個(gè)遺傳連鎖群。圖譜總遺傳長(zhǎng)度為3 885.1 cM，標(biāo)記密度為1.43 cM。利用該圖譜對(duì)PH、KNPS、GPC及TW進(jìn)行了QTL分析，其中 QC-4BS位于小麥4BS染色體的Xwmc48至IWA4662標(biāo)記區(qū)間(圖1)。 QC-4BS中控制PH的QTL位于IWA1846至IWA4662標(biāo)記區(qū)間，區(qū)間長(zhǎng)度為11.9 cM，LOD峰值接近IWA482，解釋的表型變異為15.5%～31.4%；控制KNPS的QTL主要位于 QC-4BS的Xwmc48至IWA482標(biāo)記區(qū)間，區(qū)間長(zhǎng)度為8.7 cM，LOD峰值接近IWA6850，解釋的表型變異為10.4%～15.4%；控制GPC的QTL位于 QC-4BS的Xgwm368至IWA4662標(biāo)記區(qū)間，區(qū)間長(zhǎng)度為17.5 cM，LOD峰值接近IWA6850，解釋的表型變異為7.5%～18.6%；控制TW的QTL位于 QC-4BS的IWA482至IWA4662標(biāo)記區(qū)間，區(qū)間長(zhǎng)度為11.0 cM，LOD峰值接近IWA482，解釋的表型變異為6.7%～20.4%(表1)。

圖1 QC-4BS富集區(qū)的QTL

2.2 QC-4BS富集區(qū)基因位點(diǎn)的精細(xì)定位

由QTL分析結(jié)果及其峰值所在位置可知， QC-4BS基本位于SNP標(biāo)記IWA1846至IWA4662區(qū)間內(nèi)，將該標(biāo)記區(qū)間(長(zhǎng)度為11.9 cM)對(duì)應(yīng)在660K遺傳圖譜中(未發(fā)表)，并利用已公布的小麥基因組數(shù)據(jù)(IWGSC Reference Sequence v1.0，https：//wheat-urgi.versailles.inra.fr)對(duì)該區(qū)間的基因進(jìn)行了精細(xì)定位。結(jié)果(圖2)表明，該區(qū)間對(duì)應(yīng)的物理距離約為15.17 Mb， Rht1基因(控制PH的QTL位點(diǎn))距離IWA1846約7.16 Mb；GPC和KNPS位點(diǎn)接近IWA482標(biāo)記；TW位點(diǎn)接近 Rht1基因。

2.3 Rht1基因?qū)π←溨匾r(nóng)藝性狀的效應(yīng)

Rht1基因?qū)H、KNPS、TKW、GPC及TW等性狀的效應(yīng)分析結(jié)果(表2)表明，該基因具有降低PH的效應(yīng)，在檢測(cè)的3個(gè)環(huán)境中， Rht1降低PH的效應(yīng)均達(dá)到了極顯著水平，其效應(yīng)值為9.0%～9.8%； Rht1對(duì)產(chǎn)量因子KNPS和TKW的效應(yīng)相反， Rht1顯著增加KNPS，其效應(yīng)值為3.4%～10.7%，在檢測(cè)的3個(gè)環(huán)境中均達(dá)到了顯著或極顯著水平，而 Rht1對(duì)TKW為負(fù)效應(yīng)，其降低TKW的效應(yīng)在兩個(gè)環(huán)境具有顯著差異； Rht1對(duì)品質(zhì)性狀GPC和TW均為顯著負(fù)效應(yīng)，其效應(yīng)值分別為3.3%～4.4%和0.8%～3.1%。

表1 QC-4BS富集區(qū)的QTL分析Table 1 QTL analysis of QC-4BS cluster

ST01、ST02、ST03、LA02、AL02中ST、LA和AL分別表示美國(guó)Oklahoma州的Stillwater(ST)、Lahoma(LA)和Altus(AL)，數(shù)字01、02和03代表不同年份。

The ST,LA and AL represent three Oklahoma locations,Stillwater(ST),Lahoma(LA) and Altus(AL) in USA,respectively; and 01,02,and 03 represent three different years,respectively.

圖2 QC-4BS富集區(qū)重要農(nóng)藝性狀基因的精細(xì)定位

性狀Trait株高PH/cmST01ST02ST03穗粒數(shù)KNPSST01ST02ST03千粒重TKW/gST01ST02ST03蛋白質(zhì)含量GPC/%ST01ST02ST03容重TW/(g·L-1)ST01ST02ST03表型值(Rht1+)Phenotypevalue(Rht1+)63.974.874.437.834.439.129.921.928.512.712.813.8537493527表型值(Rht1-)Phenotypevalue(Rht1-)69.682.181.136.631.136.031.024.330.213.113.314.4541509537效應(yīng)Effect/%-8.2**-8.9**-8.3**3.4*10.7**8.5**-3.7-10.1**-5.5*-3.3**-3.9**-4.4**-0.8*-3.1**-1.8**

**：P<0.01；*：P<0.05.

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn) QC-4BS位于小麥4BS染色體上的Xwmc48至IWA4662標(biāo)記區(qū)間，在該區(qū)間前人也曾定位到了與小麥產(chǎn)量、株高、抽穗期、粒重、收獲指數(shù)、成穗數(shù)、穗粒數(shù)及成熟期等性狀相關(guān)的QTL[16-21]，表明 QC-4BS的確是一個(gè)小麥重要農(nóng)藝性狀的QTL富集區(qū)。本研究根據(jù)小麥660K連鎖圖譜及小麥基因組數(shù)據(jù)對(duì) QC-4BS區(qū)間的基因進(jìn)行了精細(xì)定位，將 QC-4BS定位在WA1846至IWA4662標(biāo)記區(qū)間，其對(duì)應(yīng)的物理距離為15.17 Mb。已知 QC-4BS中控制株高的QTL為 Rht1基因[20]，距離IWA1846標(biāo)記約7.16 Mb，根據(jù)GPC和KNPS的峰值位點(diǎn)標(biāo)記 IWA6850/IWA1846及TW的峰值位點(diǎn)標(biāo)記 IWA482，將控制KNPS、GPC及TW的位點(diǎn)定位在 Rht1附近。目前，在 QC-4BS富集區(qū)還未定名任何與產(chǎn)量及品質(zhì)性狀相關(guān)的基因，而本研究在該區(qū)間定位的與KNPS、GPC及TW相關(guān)的QTL在多個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到，且具有相對(duì)較大的遺傳效應(yīng)，表明該區(qū)間存在與產(chǎn)量及品質(zhì)性狀相關(guān)的基因。相關(guān)性分析結(jié)果表明，不同環(huán)境中的PH、 KNPS、GPC及TW之間均存在顯著相關(guān)性，具體表現(xiàn)為PH與KNPS為負(fù)相關(guān)，而與GPC和TW為正相關(guān)；KNPS與GPC和TW之間為負(fù)相關(guān)，而且IWA482、IWA1846、IWA6850、IWA4662等標(biāo)記與這些性狀緊密連鎖，表明這些性狀之間可能存在一因多效或基因互作效應(yīng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在 QC-4BS中增加PH、GPC和TW的等位基因及減少KNPS的等位基因來(lái)自親本寧7840。單倍型分析顯示RIL群體中與寧7840基因型一致的株系平均PH、GPC及TW均顯著高于其他株系，而KNPS低于其他株系，即高株、高蛋白質(zhì)含量、高容重及低穗粒數(shù)為連鎖性狀，因此在育種中宜根據(jù)育種目的進(jìn)行 QC-4BS富集區(qū)優(yōu)異基因的聚合及優(yōu)良性狀的選擇。此外，IWA482、IWA1846、IWA6850、IWA4662等標(biāo)記可以作為這些性狀的選擇標(biāo)記。

本研究對(duì) Rht1基因?qū)π←淧H、KNPS、TKW、GPC及TW的效應(yīng)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示 Rht1基因具有降低株高的作用，其降稈效應(yīng)為8.2%～8.9%，比其他研究中的 Rht1的降稈強(qiáng)度(20%～25%)相對(duì)較弱[22-25]，這可能是因?yàn)楸狙芯坎捎玫难芯咳后w較為特殊，在該群體中還檢測(cè)到了另外一個(gè)矮稈基因 Rht12(QPh.hwwgr-5AL)及其他矮稈位點(diǎn)[22]，這些基因位點(diǎn)間的互作導(dǎo)致了該群體株高存在復(fù)雜的變異。前人研究表明，矮稈基因?qū)π←溎承┺r(nóng)藝性狀是有影響的，尤其是產(chǎn)量和品質(zhì)性狀[25-26]。 Rht1及 Rht2為赤霉酸不敏感基因，研究表明這類(lèi)矮稈基因在選育品種中分布較廣，除了降低株高，防倒伏外，還具有增加小穗結(jié)實(shí)率、降低粒重和蛋白質(zhì)含量的效應(yīng)[27-29]。Mccartney等[30]對(duì)春小麥農(nóng)藝性狀QTL研究發(fā)現(xiàn)， Rht1位點(diǎn)往往與產(chǎn)量構(gòu)成因子的QTL熱點(diǎn)區(qū)域重合。本研究中采用RIL家系同樣發(fā)現(xiàn) Rht1具有顯著增加小麥穗粒數(shù)、降低蛋白質(zhì)含量及千粒重的效應(yīng)，這與前人的研究結(jié)果[25-28]是一致的。而且， Rht1基因與KNPS、GPC及TW位點(diǎn)緊密連鎖，這些研究結(jié)果進(jìn)一步表明，在小麥育種選擇中注重株高選擇的同時(shí)要兼顧產(chǎn)量性狀及品質(zhì)性狀的選擇。

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