吳 斌，郭 霞，張 眉，姜珊珊，辛志梅，王升吉，辛相啟

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

小麥莖基腐病(wheat crown rot，WCR)是小麥生產(chǎn)中的主要真菌病害，小麥從苗期到成株期均可感此病，起初病菌可從幼芽鞘侵入，使幼根和芽鞘變褐、腐爛，即使出苗也生長細(xì)弱，莖基部變褐，中后期病部逐漸蔓延至小麥第一、二節(jié)莖，導(dǎo)致病部變褐、腐爛，發(fā)病較輕的病株穗粒干癟，嚴(yán)重時(shí)穗部結(jié)成“白穗”，結(jié)實(shí)率大大降低，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。

國內(nèi)外研究表明，小麥莖基腐病的病原菌組成比較復(fù)雜，且因各地生態(tài)環(huán)境不同，優(yōu)勢致病菌也不同。美國和澳大利亞相關(guān)研究者發(fā)現(xiàn)，引起小麥莖基腐病害的病原菌主要是假禾谷鐮孢菌(Fusariumpseudograminearum)[3]，在中國引起小麥莖基腐病的病原菌包括鐮孢菌(Fusariumspp.)、根腐離蠕孢菌(Bipolarissorokiniana)、交鏈孢菌(Alternariaspp.)、雪霉葉枯菌(Microdochiumnivale)和黑附球菌(Epicoccumnigrum)等，但主要且致病力最強(qiáng)的致病菌是鐮孢菌，交鏈孢菌次之[4-5]。

近年來，由于實(shí)施秸稈還田，土壤中的菌源不斷積累，且現(xiàn)有栽培品種抗性較差、農(nóng)事操作粗放，加之氣候因素影響，小麥莖基腐病在我國河南、河北、山東、安徽等省份普遍發(fā)生，而且呈現(xiàn)不斷加重和蔓延趨勢[6-8]。2016年魯西北、魯南地區(qū)普遍發(fā)生小麥莖基腐病害，重病田植株發(fā)病率達(dá)10%～30%，但是對(duì)這些地區(qū)該病害的病原菌組成和致病力等一直缺乏系統(tǒng)研究。本研究對(duì)山東省7個(gè)地方表現(xiàn)有莖基腐病癥狀的小麥植株進(jìn)行采樣及病原菌分離，利用分子生物學(xué)方法對(duì)獲得的菌株進(jìn)行鑒定及同源性分析，在溫室開展苗期致病力測定，以期為該病的防治和抗病育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品：2016年5月采集自山東省小麥莖基腐病發(fā)病嚴(yán)重的7個(gè)地點(diǎn)共105個(gè)病株(表1)。試驗(yàn)所用小麥品種均為濟(jì)南15。

1.2 病原菌的分離

參照方中達(dá)[9]的方法，選取小麥?zhǔn)芮秩靖o部的病健交界處，采用70%(v/v)的酒精進(jìn)行組織表面消毒，無菌水沖洗5次，在無菌濾紙上晾干后置于PDA培養(yǎng)基平板上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)，2 d后選取具真菌特征的菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上以獲得純培養(yǎng)，每個(gè)地點(diǎn)挑取菌落生長性狀不同的菌株純化培養(yǎng)，備用。

1.3 基因組DNA的提取

純化后的菌株培養(yǎng)3～5 d，收集菌絲至2 mL的Eppendorf離心管中，用液氮迅速冷凍并快速研磨成粉末，采用真菌基因組DNA提取試劑盒(HP Fungal DNA Kit，Omega公司，美國)提取所有分離菌株的基因組DNA。

1.4 菌株的鑒定與序列分析

采用真菌rDNA-ITS通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增所有分離菌株基因組的ITS區(qū)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]對(duì)目的條帶進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測序，獲得序列在NCBI中進(jìn)行Blast檢索比對(duì)。

對(duì)于ITS鑒定結(jié)果為鐮孢菌的菌株進(jìn)行EF-1α基因和β-tublin基因擴(kuò)增，引物為 EF1T(5′-ATGGGTAAGARGACAAGAC-3′)和EF2T(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)、T1(5′-AACATGCGTGAGATTCTAAGT-3′)和T2(5′-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3′)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[10]。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后切膠、回收，回收產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。

采用軟件DNAStar(ver. 6.1)對(duì)所有被測鐮孢菌的序列進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換和初步整理，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載鐮孢菌典型分離物的 EF-1α基因序列，利用軟件MEGA(ver. 4.1)的鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支置信度(Bootstrap)進(jìn)行500次重復(fù)分析。

1.5 病原菌的致病力測定

對(duì)分離得到的鐮孢菌菌株在溫室條件下進(jìn)行小麥苗期致病力的測定。挑取飽滿的濟(jì)南15小麥種子，播種于裝有無菌土(121 ℃高溫滅菌1 h)的塑料缽(直徑為9 cm)中，每盆播20～25粒，上面覆蓋滅菌的蛭石，置于25 ℃的溫室。當(dāng)小麥長至2葉期時(shí)，選取大小基本一致的小麥種子，于無菌水中浸泡過夜(約16 h)后，置于150 mL三角瓶中，每瓶約15 g種子，121 ℃滅菌1 h，待完全冷卻后接入在PDA培養(yǎng)基上生長7 d的鐮孢菌菌株，28 ℃靜置培養(yǎng)7～10 d，每隔2 d搖晃三角瓶使每粒種子帶菌量盡量一致。當(dāng)小麥生長至三葉一心時(shí)，在每株小麥的根部土壤中放置一粒帶菌小麥種子，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20株小麥，28 ℃保濕培養(yǎng)。接種病原菌3周后，參考李 偉等[5]調(diào)查紋枯病的9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)并適當(dāng)修改，調(diào)查病害發(fā)生情況。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無癥狀；1級(jí)，外層葉鞘有明顯的褐色或黑褐色斑，但病斑小于1/2直徑，第1片葉明顯褪綠黃化；3級(jí)，外層葉鞘有明顯的褐色或黑褐色斑，病斑大于1/2直徑，但內(nèi)層葉鞘無癥狀，第2片葉葉尖褪綠黃化；5級(jí)，內(nèi)層葉鞘有褐色或黑褐色斑，但病斑小于1/2直徑，第1片葉枯死，第2片葉整葉黃化；7級(jí)，內(nèi)層葉鞘有褐色或黑褐色斑，病斑大于1/2直徑，第2片葉枯死，第3片葉有明顯褐枯，但植株不死苗；9級(jí)，植株枯死。

利用下列公式計(jì)算病情指數(shù)，病情指數(shù)=Σ(各病級(jí)株數(shù)×各病級(jí)代表值)/(總株數(shù)×最高級(jí)代表值)×100。根據(jù)病原菌侵染小麥植株表現(xiàn)出的相關(guān)癥狀，每個(gè)菌株的3個(gè)重復(fù)各選取3株具有小麥莖基腐病典型癥狀的病株，每株發(fā)病葉鞘各剪取3份材料，分別進(jìn)行病原菌的重新分離，每株菌的重新分離率=分離到與原接種菌相同菌落的材料數(shù)/總分離材料數(shù)×100%。重分離菌的鑒定同1.4。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用DPS(ver. 7.5)對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與鑒定

對(duì)所有小麥病樣選取癥狀明顯的根莖部組織進(jìn)行常規(guī)真菌分離，共獲得真菌菌株45株(表1)。采用真菌rDNA-ITS通用引物 ITS1/ ITS4擴(kuò)增分離菌株基因組的ITS區(qū)，獲得片段約為600 bp目的條帶。ITS序列分析表明，22株為鐮孢菌(圖1)，其余菌株屬于鏈格孢菌。聊城市高唐縣固河鎮(zhèn)共分離到3株鐮孢菌，編號(hào)為GW1-3；高唐縣趙莊鄉(xiāng)(GD)共分離得到4株鐮孢菌，編號(hào)為GD1-4；茌平縣溫陳鄉(xiāng)(CW)分離到的3株鐮孢菌，編號(hào)為CW1-3；茌平縣韓屯鎮(zhèn)樣品(CH)得到的3株鐮孢菌，編號(hào)為CH1-3；德州市齊河縣焦廟鎮(zhèn)樣品共分離到4株鐮孢菌，編號(hào)為QH1-4；禹城市房寺鎮(zhèn)樣品(YC)分離到的3株鐮孢菌，編號(hào)為YC1-3；臨沂市莒南縣板泉鎮(zhèn)樣品共分離到2株鐮孢菌，編號(hào)為JC1-2。

對(duì)22株鐮孢菌進(jìn)一步擴(kuò)增EF-1α及β-tublin基因，BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)基因比對(duì)分析表明，聊城市4個(gè)采樣點(diǎn)共獲得9株假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)和4株禾谷鐮孢菌(F.graminearum)；德州市2個(gè)采樣點(diǎn)的7個(gè)菌株，除禹城市的1株為禾谷鐮孢菌外，其余6株均為假禾谷鐮孢菌；臨沂市1個(gè)采樣點(diǎn)獲得2株亞洲鐮孢菌。22株鐮孢菌中，假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)的分離頻率最高，為68.18%；其次為禾谷鐮孢菌(F.graminearum)，分離頻率為22.73%，亞洲鐮孢菌(F.asiaticum)的分離頻率為9.09%。

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

對(duì)獲得的22株鐮孢菌的 EF-1α基因進(jìn)行擴(kuò)增，與GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)測試菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中相近種菌株的 EF-1α基因序列同源性達(dá)到98%～100%，GenBank數(shù)據(jù)庫中的42個(gè) EF-1α基因序列信息見表2，采用軟件MEGA (ver. 4)的鄰接法(neighbor- joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2。由圖2可以看出，分離菌株GD1、GD2、GD3、GD4和YC3共5個(gè)菌株與禾谷鐮孢菌(F.graminearum)菌株聚類在一個(gè)組，自展支持率為59；分離菌株JC1和JC2與亞洲鐮孢菌(F.asiaticum)菌株聚類在一個(gè)組，自展支持率為57；這兩個(gè)組聚類在一個(gè)大組，且自展支持率為100；而其余的分離菌株GW1、GW2、GW3、CW1、CW2、CW3、CH1、CH2、CH3、QH1、QH2、QH3、QH4、YC1和YC2共15個(gè)菌株與假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)的所有菌株聚類在另外一個(gè)大組，聚類結(jié)果和測序分析結(jié)果一致。從菌株的地區(qū)分布來看，采自聊城市高唐縣趙莊鄉(xiāng)的4個(gè)菌株(GD1、GD2、GD3和GD4)親緣關(guān)系較近，禹城市房寺鎮(zhèn)房寺村的1個(gè)菌株YC3與這4個(gè)菌株聚類在同一個(gè)分支，并且菌株YC3和GD1的親緣關(guān)系非常近；分離自臨沂市莒南縣的2株JC1和JC2聚類在一同個(gè)分支；假禾谷鐮孢菌的地區(qū)分布規(guī)律不明顯。

表1 采樣點(diǎn)及所分離病原菌的種類及數(shù)量Table 1 Information of sample collection and type and number of pathogens that were isolated

M:DL2000 Maker; 1-3:GW1-3; 4-7:GD1-4; 8-10:CW1-3; 11-13:CH1-3; 14-17:QH1-4; 18-20:YC1-3; 21-22:JC1-2.

圖122株鐮孢菌的ITS區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCRamplificationwithITS1/ITS4primersforITSregionof22Fusariumspp.

2.3 病原菌的致病力

在溫室條件下，通過病麥粒接種法對(duì)22株鐮孢菌進(jìn)行盆栽苗的致病力測定。結(jié)果表明，小麥苗接種病原菌7 d后開始出現(xiàn)癥狀，起初第一片葉變黃萎蔫，由葉鞘處開始出現(xiàn)黑褐色病斑。隨著侵染時(shí)間的延長，小麥莖基部病斑自下而上、由外到內(nèi)擴(kuò)展，接種3周后，發(fā)病嚴(yán)重的小麥植株枯萎，甚至死亡。

22株鐮孢菌對(duì)供試小麥均有致病性(表3)，且假禾谷鐮刀菌的致病力明顯強(qiáng)于禾谷鐮刀菌及亞洲鐮孢菌，后2種病原菌的致病力差異不顯著。從病原菌分離的地區(qū)來看，德州市的假禾谷鐮孢菌株的平均病情指數(shù)均達(dá)到79以上，齊河縣有2株菌株QH2和QH4的平均病情指數(shù)大于90，分別為97.64和90.85，此外，平均病情指數(shù)大于90的菌株還有分離自德州市高唐縣的菌株GW2。

3種鐮孢菌均可引起小麥發(fā)病，但是癥狀略有不同(圖2、圖3)。接種假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)的小麥植株莖基部癥狀明顯，發(fā)病嚴(yán)重，濕度大時(shí)基部葉鞘上產(chǎn)生紅色分生孢子粉層；禾谷鐮孢菌(F.graminearum)根部的病麥粒外層被淺黃色菌絲球包裹，莖基腐癥狀不太明顯，發(fā)病程度輕；接種亞洲鐮孢菌(F.asiaticum)的小麥植株莖基部癥狀明顯，發(fā)病不嚴(yán)重，濕度大時(shí)基部葉鞘上產(chǎn)生紅色分生孢子粉層。就接種病株分離得率而言，假禾谷鐮孢菌、禾谷鐮孢菌及亞洲鐮孢菌分別為55.56%、45.46%和100%，所有重新分離得到的菌株經(jīng)測序鑒定均與接種病原菌種類相同。

表2 GenBank數(shù)據(jù)庫中的42個(gè)EF-1α基因信息Table 2 Data of forty two EF-1α gene in GenBank database

-:未查到寄主名稱。

-：No host finded.

3 討 論

小麥莖基腐病是由多種病原菌引起的一種重要的土傳病害，其田間發(fā)生情況較為復(fù)雜，病原分布及組成因地區(qū)差異、氣候變化而不同[8,11]，并且同一地塊莖基腐病和赤霉病復(fù)合侵染常同時(shí)發(fā)生，對(duì)病原菌研究及病害防治造成一定的困難。而且這兩種病害在病原菌的生物學(xué)特性、致病力及病害的流行上也存在聯(lián)系，從小麥莖基部可以分離到赤霉病的主要致病菌禾谷鐮孢菌(F.graminearum)，而引起澳大利亞小麥莖基褐腐的病原菌假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)也曾導(dǎo)致赤霉病的流行[1,12-13]。

圖2 基于EF1-α基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，不同國家或地區(qū)小麥莖基腐病的病原菌組成不同。澳大利亞地區(qū)引起小麥莖基腐病的主要病原菌為假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)，美國的小麥莖基腐病病原菌包括假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)、黃色鐮孢菌(F.culmorum)和燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)等，歐洲小麥莖基腐病的主要致病菌為黃色鐮孢菌[1,3]。2009-2010年，李 偉等[5]對(duì)引起江蘇、安徽、河南、湖北、河北和四川6個(gè)省份小麥莖基腐病的病原菌進(jìn)行了鑒定分析，發(fā)現(xiàn)其病原菌主要為小麥根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)和鐮孢菌(Fusariumspp.)。張向向等[2]對(duì)5個(gè)冬小麥主產(chǎn)省份的莖基腐病病原菌組成的研究發(fā)現(xiàn)，分離得到的鐮孢菌中亞洲鐮孢菌菌株所占比例最大，達(dá)76.30%，其余依次為禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)、假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)和燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)。近年來的研究報(bào)道均表明侵染我國小麥的莖基腐鐮孢屬病原菌種類主要為禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和亞洲鐮孢菌(F.asiaticum)，并且禾谷鐮孢菌菌株多數(shù)分布在年平均氣溫低于15 ℃的寒冷地區(qū)，比如黃淮麥區(qū)和北方麥區(qū)，而亞洲鐮孢菌常分布在年平均氣溫高于15 ℃的溫暖地區(qū)，如長江流域的江蘇等省[14]，表明我國莖基腐病病原鐮孢菌組成與北美洲以及澳大利亞有所差別。

表3 22株鐮孢菌致病力Table 3 Pathogenicity of 22 Fusarium spp.

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；平均病情指數(shù)后的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Data were mean value± SE(standard error); Different letters following data of mean disease index were significant difference among isolates at 0.05 level.

a:田間發(fā)病癥狀；B:病菌回接癥狀；C:對(duì)照。

a:Symptom of natural infection; B:Symptom of diseased wheat after inoculation; C:Control.

圖3小麥接種F.pseudograminearum后發(fā)病癥狀

Fig.3SymptomsofwheatthatwereinoculatedF.pseudograminearum

a:對(duì)照；B：發(fā)病程度輕；C：發(fā)病程度重。

A：Control; B：The lower disease degree; C：The higher disease degree.

圖4小麥濟(jì)南15莖基腐致病力測定

Fig.4PathogenicityofthecrownrottowheatJinan15cultivars

本研究通過對(duì)山東省小麥莖基腐病嚴(yán)重發(fā)生地區(qū)2016年小麥莖基腐病害樣品的采集、分離，對(duì)獲得的鐮孢菌菌株進(jìn)行了分類鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引起這些地區(qū)小麥莖基腐病的病原菌有3種，分別為假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和亞洲鐮孢菌(F.asiaticum)，其中分離數(shù)量最多的是假禾谷鐮孢菌，致病力也最強(qiáng)，平均病情指數(shù)均達(dá)到79以上，甚至大于90。2012年Li等[15]首次在我國報(bào)道了由假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)引起的小麥莖基腐病，分離頻率僅為5.97%，張向向等[2]于2012年僅在江蘇的小麥莖基腐病病株上分離到假禾谷鐮孢菌1株。與此形成鮮明對(duì)比的是，本研究中假禾谷鐮孢菌的分離比例較高，由此表明，山東小麥莖基腐病病原菌優(yōu)勢菌群的組成及其致病力程度可能已經(jīng)發(fā)生了變化，需要引起重視。另外，本研究還分離得到了23株鏈格孢菌(Alternariaspp.)，經(jīng)過測序鑒定發(fā)現(xiàn)其菌株種類單一，大多數(shù)為細(xì)極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)，還有少量的鏈格孢菌(A.alternata)，前人報(bào)道中有提及鏈格孢菌屬(Alternariaspp.)為小麥莖基腐的病原菌，但致病力較鐮孢菌(Fusariumspp.)弱[5]，且該類病原菌主要引起小麥根腐病，故未對(duì)其進(jìn)行深入研究。

到目前為止，尚未有標(biāo)準(zhǔn)的小麥莖基腐發(fā)病程度評(píng)估方法，研究者常根據(jù)莖基部褐色病斑大小、葉鞘發(fā)病級(jí)別、莖基腐病情指數(shù)等判別病情程度，而且國內(nèi)對(duì)小麥莖腐病抗源的篩選報(bào)道較少，還未發(fā)現(xiàn)對(duì)該病害表現(xiàn)免疫或者高抗的品種，特別是缺乏適宜山東各麥區(qū)的抗病種質(zhì)。因此，建議加強(qiáng)小麥抗莖腐病種質(zhì)資源的篩選，并且建立統(tǒng)一、合理的莖基腐抗性鑒定體系，制定適宜的病害評(píng)價(jià)體系，以便于不同研究者對(duì)鑒定結(jié)果的相互比較，提高防治病害的有效性。

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