張潤(rùn)琪，李 誠(chéng)，付凱勇，李 超，徐芳芳，朱永琪，覃安祥，李春艷

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

淀粉是小麥籽粒的主要組成成分，根據(jù)結(jié)構(gòu)差異可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉[1]，其中支鏈淀粉占淀粉含量的70%～80%，其構(gòu)型直接影響淀粉的理化特性和加工、食用品質(zhì)[2]。支鏈淀粉的主鏈通過(guò)α-1,4-糖苷鍵連接而成，支鏈通過(guò)α-1,6-糖苷鍵與主鏈相連，可分為A、B和C三種鏈[3]，其中，C鏈為主鏈，B鏈為C鏈的支鏈，而A鏈為B鏈的側(cè)鏈。前人將支鏈淀粉的色譜圖分為3 部分[4]:A鏈:DP 6～18，B1鏈:DP 19～34，B2鏈:DP>35。

淀粉的合成與結(jié)構(gòu)不但與其遺傳特性有關(guān)，還受栽培過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)水平的影響[5]。磷素是作物必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，施加磷肥是緩解土壤低磷脅迫、改善作物產(chǎn)量和品質(zhì)的有效方法。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成的關(guān)鍵酶之一，在植物葉片中受變構(gòu)調(diào)節(jié)，被 3-磷酸甘油酸激活而被無(wú)機(jī)磷酸所抑制，3-磷酸甘油酸與無(wú)機(jī)磷酸的比值影響其活性，從而調(diào)節(jié)淀粉的合成[6]?？扇苄缘矸酆铣擅?SSS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(DBE)是負(fù)責(zé)支鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶[7]，分別由其對(duì)應(yīng)的酶基因編碼[8]。其中，SBE的兩種同工酶均可被磷酸鹽激活[9]。磷素對(duì)淀粉的合成有重要影響。姜宗慶等[10]研究表明，在施磷(P2O5)量0 ～ 108 kg·hm-2范圍內(nèi)，小麥籽粒直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉積累量、積累速率均隨施磷量的增加而上升。此外，磷對(duì)淀粉的品質(zhì)特性也有顯著影響，Li等[11]研究表明，施磷顯著提高了小麥新冬20號(hào)籽粒淀粉中B型淀粉粒的比例，對(duì)其持水力、膨脹勢(shì)、溶解性等也有顯著影響。前人對(duì)于磷素影響小麥支鏈淀粉含量及支鏈淀粉合成關(guān)鍵酶活性已有研究，如Ni等[12]研究發(fā)現(xiàn)，施磷顯著提高了成熟期小麥籽粒中的支鏈淀粉含量，王旭東[13]的研究表明，施磷提高了花后28 d之前籽粒中蔗糖合成酶(SS)、顆粒淀粉合成酶(GBSS)和可溶性淀粉合成酶(SSS)的活性，提高了花后14～28 d 籽粒中AGPase的活性，但關(guān)于磷素影響小麥支鏈淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)及鏈長(zhǎng)分布的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究選用不同冬小麥品種，測(cè)定不同磷素水平下淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量以及對(duì)應(yīng)酶的活性、籽粒支鏈淀粉含量、支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布和籽粒全磷含量，探究不同磷素水平對(duì)小麥籽粒支鏈淀粉合成及其鏈長(zhǎng)分布的調(diào)控效應(yīng)，以期揭示小麥支鏈淀粉的積累特征，為預(yù)測(cè)小麥淀粉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

供試材料選用新冬20號(hào)(南疆主栽品種)和新冬23號(hào)(北疆強(qiáng)筋面包小麥)，由石河子大學(xué)麥類作物研究所提供。

試驗(yàn)于2014年10月至2015年6月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站(44°17′N, 86°03′E)進(jìn)行。前茬作物為向日葵，土質(zhì)為灰漠土，0～20 cm 土層內(nèi)含堿解氮63 mg·kg-1、速效磷15 mg·kg-1、速效鉀208 mg·kg-1。播種時(shí)按75 kg·hm-2施加尿素，灌溉方式為滴灌，冬前澆水3次，返青至成熟每隔10～12 d澆水一次，共澆水6次，每次滴水量1 125 m3·hm-2，總滴水量10 125 m3·hm-2。在拔節(jié)期、抽穗期和揚(yáng)花期分別隨水施尿素45、75和120 kg·hm-2。

隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3個(gè)重復(fù)，小區(qū)面積2.4 m×3 m，小區(qū)之間隔離帶寬度為50 cm。設(shè)置3個(gè)磷素(P2O5)水平分別為0、105和210 kg·hm-2，分別用CK(對(duì)照)、CP(常規(guī)施磷)和HP(過(guò)量施磷)表示，所用肥料為重過(guò)磷酸鈣，在播種后160 d(大約5%的植株已返青)開(kāi)溝條施。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

從每個(gè)小區(qū)選取同日開(kāi)花的麥穗做好標(biāo)記，分別在花后7、14、21、28和35 d在每個(gè)小區(qū)剝?nèi)∷胫胁康淖蚜?，同處理籽粒集中到一起，一部分?jīng)液氮速凍5 min后保存于-80 ℃冰箱，用于測(cè)定酶活性和提取RNA；另一部分于105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重備用。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

(1)籽粒支鏈淀粉含量的測(cè)定 取烘干的小麥籽粒用實(shí)驗(yàn)室粉碎磨(JFSD-70，上海嘉定)打成粉末，參照趙永亮[14]的方法測(cè)定。

(2)胚乳淀粉粒的提取 參照Peng等[15]的方法提取，常溫干燥后于-20 ℃保存。

(3)支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布的測(cè)定 參照賀 偉等[16]的方法。

(4)籽粒全磷含量的測(cè)定 取烘干的小麥籽粒用實(shí)驗(yàn)室粉碎磨(JFSD-70，上海嘉定)打成粉末，參照鮑士旦[17]的方法測(cè)定。

(5)支鏈淀粉合成相關(guān)酶活性的測(cè)定 胚乳SS酶活性的測(cè)定參照Douglas等[18]的方法；SBE酶活性的測(cè)定參照趙法茂等[19]的方法；DBE酶活性的測(cè)定參照劉 霞等[20]的方法。

1.2.3 支鏈淀粉合成相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

(1)引物設(shè)計(jì) 使用Primer Premier 5.0.軟件，根據(jù)NCBI上公布的小麥籽粒淀粉合成相關(guān)酶基因的序列，設(shè)計(jì) sbe1, sbe2a, sbe2b和 iso1基因的引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用小麥actin基因(NCBI編號(hào)DN551593)作為內(nèi)參。通過(guò)梯度PCR驗(yàn)證引物特異性同時(shí)優(yōu)化PCR條件。

(2) RNA的提取和cDNA的合成 用Fruit-mate(Takara)和RNAiso plus(Takara)試劑盒提取RNA，按說(shuō)明書操作，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取的總RNA質(zhì)量。使用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(Tiangen, Cat#KR104-02, China)合成cDNA，用其作為模板擴(kuò)增actin基因以檢驗(yàn)其質(zhì)量。

(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用SYBR Premix ExTaq試劑盒(Takara)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480 Ⅱ)上檢測(cè)各個(gè)基因的擴(kuò)增情況，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，用SPSS 11.5進(jìn)行單因素方差分析，采用鄧肯法(Duncan)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷素處理對(duì)支鏈淀粉合成相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

施磷顯著提高了兩個(gè)小麥品種花后14～28 d胚乳中 sbe1基因的相對(duì)表達(dá)量(圖1)，且CP處理顯著高于HP處理(花后28 d除外)。新冬20號(hào)胚乳中 sbe1基因的相對(duì)表達(dá)量總體低于新冬23號(hào)。對(duì)照條件下，新冬20號(hào)胚乳中 sbe1基因相對(duì)表達(dá)量在花后28 d達(dá)到峰值，而新冬23號(hào)則在花后21 d達(dá)到峰值。CP處理下兩個(gè)參試品種 sbe1基因的相對(duì)表達(dá)量基本呈先上升后下降的趨勢(shì)，均在花后21 d達(dá)到峰值。HP處理下新冬20號(hào)胚乳中 sbe1基因的相對(duì)表達(dá)量呈雙峰分布，而新冬23號(hào)則呈單峰分布?；ê?5 d，隨著種子的成熟，兩品種各處理下胚乳中 sbe1基因的相對(duì)表達(dá)量降至最低值。

施磷顯著提高了兩參試品種花后14～28d胚乳中 sbe2a基因的相對(duì)表達(dá)量(圖2)，且CP處理顯著高于HP處理。新冬20號(hào)胚乳中 sbe2a基因的相對(duì)表達(dá)量整體低于新冬23號(hào)。對(duì)照條件下兩品種胚乳中 sbe2a基因的相對(duì)表達(dá)量均較低；CP處理下新冬20號(hào)胚乳中 sbe2a基因的相對(duì)表達(dá)量在花后7 d最高，而新冬23號(hào)則在花后14 d達(dá)到峰值；HP處理下兩參試品種胚乳中 sbe2a基因的相對(duì)表達(dá)量均在花后14 d達(dá)到峰值。

A：新冬20；B：新冬23。圖柱上不同字母表示處理間差異在0.05水平顯著。下同。

A：Xindong 20;B:Xindong 23.Different letters above columns mean significant difference among treatments at 0.05 level. The same below.

圖1不同磷處理下小麥胚乳sbe1基因的相對(duì)表達(dá)量

Fig.1Relativeexpressionofsbe1inwheatendospermunderdifferentphosphoruslevels

如圖3所示，施磷可不同程度提高兩個(gè)小麥品種胚乳中 sbe2b基因的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照和CP處理下新冬20號(hào)胚乳中 sbe2b基因的相對(duì)表達(dá)量均在花后7 d最高，隨后不斷降低，而HP處理下則呈先上升后下降的趨勢(shì)，在花后14 d達(dá)到峰值。各處理下新冬23號(hào)胚乳中 sbe2b基因的相對(duì)表達(dá)量均呈先升后降之勢(shì)，都在花后14 d達(dá)到峰值。

圖2 不同磷處理下小麥胚乳 sbe2a基因的相對(duì)表達(dá)量

圖3 不同磷處理下小麥胚乳 sbe2b基因的相對(duì)表達(dá)量

圖4 不同磷處理下小麥胚乳 iso1基因的相對(duì)表達(dá)量

如圖4所示，施磷顯著提高了兩個(gè)參試品種花后7～28 d胚乳中 iso1基因的相對(duì)表達(dá)量(新冬20花后7、28 d除外)，且CP處理下顯著高于HP處理(花后28 d除外)。對(duì)照條件下兩參試品種胚乳中 iso1基因的相對(duì)表達(dá)量均較低，且各時(shí)期變化不大。CP和HP處理下兩品種胚乳中 iso1基因的相對(duì)表達(dá)量均呈先升后降之勢(shì)，都在花后14 d達(dá)到表達(dá)峰值；花后35 d，隨著灌漿的完成，兩品種胚乳中 iso1基因的相對(duì)表達(dá)量下降至最低。

2.2 不同磷處理對(duì)支鏈淀粉合成相關(guān)酶活性的影響

磷處理對(duì)小麥胚乳中SS酶活性的影響存在品種間差異(圖5)，CP處理顯著提高了新冬20號(hào)胚乳中的SS酶活性(花后14 d除外)，促進(jìn)了淀粉合成原料蔗糖向籽粒的供應(yīng)；除花后14 d外，HP處理下新冬20號(hào)籽粒發(fā)育各時(shí)期胚乳SS酶活性均顯著高于同期對(duì)照，花后35 d達(dá)到峰值；對(duì)照條件下胚乳中的SS酶活性呈升-降-升之勢(shì)，在花后14 d達(dá)到最大值。CP處理下新冬23號(hào)的胚乳SS酶活性呈升-降-升的趨勢(shì)，在花后35 d達(dá)到峰值且顯著高于同期HP和對(duì)照處理；HP處理下新冬23號(hào)的胚乳SS酶活性整體呈先升后降之勢(shì)，在花后21 d達(dá)到最大值且顯著高于同期對(duì)照和CP處理；對(duì)照條件下的胚乳SS酶活性呈降-升-降的趨勢(shì)，在花后28 d達(dá)到峰值。

圖5 不同磷處理下的小麥胚乳SS酶活性

如圖6所示，新冬20號(hào)胚乳中的SBE酶活性CP處理下呈先升后降的趨勢(shì)，在花后14 d達(dá)到最大值且顯著高于同期HP和對(duì)照處理；在HP處理下呈升-降-升之勢(shì)，分別在花后14 d和35 d有最高峰和次高峰，且顯著高于同期對(duì)照處理；對(duì)照條件下胚乳SBE酶活性在籽粒灌漿期間逐漸下降。各處理下新冬23號(hào)胚乳中的SBE酶活性均在花后7 d酶活最高。

圖6 不同磷處理下的小麥胚乳SBE活性

如圖7所示，對(duì)照條件下新冬20號(hào)胚乳中的DBE酶活性呈降-升-降之勢(shì)，花后28 d達(dá)到最大值；CP和HP處理下新冬20號(hào)胚乳中的DBE酶活性均在花后7 d最高，且CP處理下顯著高于對(duì)照。相比于對(duì)照，施磷處理提前了新冬20號(hào)胚乳中DBE酶活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間。對(duì)照和HP處理下新冬23號(hào)胚乳中的DBE酶活性均在花后7 d最高，之后則呈降-升-降的趨勢(shì)；CP處理下胚乳中的DBE酶活性呈升-降-升之勢(shì)，花后14 d達(dá)到最大值且顯著高于同期對(duì)照和HP處理。

2.3 不同磷處理對(duì)籽粒支鏈淀粉含量的影響

如圖8所示，兩品種籽粒中的支鏈淀粉含量在灌漿早期都很低，隨著籽粒的發(fā)育，其支鏈淀粉含量逐步提高。花后7 d時(shí)不同磷處理下的支鏈淀粉含量無(wú)顯著差異，在此之后施磷顯著或不顯著提高了籽粒中支鏈淀粉的含量，成熟期(花后35 d)籽粒中CP處理下的支鏈淀粉含量最高，且顯著高于對(duì)照和HP處理。

2.4 不同磷處理對(duì)籽粒支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布的影響

由表2可以看出，CP處理提高了兩品種支鏈淀粉中B鏈所占的比例。新冬20號(hào)各處理下支鏈淀粉中B鏈所占比例隨籽粒的發(fā)育不斷上升，而新冬23號(hào)對(duì)照的支鏈淀粉中B鏈所占比例呈先下降后上升的趨勢(shì)，HP處理下呈先上升后下降的趨勢(shì)，CP處理下則在花后各時(shí)期變化不大。

圖7 不同磷處理下的小麥胚乳DBE活性

圖8 不同磷處理下的小麥籽粒支鏈淀粉含量

2.5 不同磷處理對(duì)籽粒中全磷含量的影響

如圖9所示，CP處理下，新冬20號(hào)花后7 d、21 d和28 d以及新冬23號(hào)花后21 d籽粒中全磷含量顯著高于對(duì)照，其他時(shí)期及HP處理與對(duì)照相比并無(wú)顯著差異，說(shuō)明CP處理有提高籽粒全磷含量的趨勢(shì)，但并不明顯；花后35 d，隨著種子的成熟，兩參試品種各處理下籽粒中的全磷含量無(wú)顯著差異。

3 討 論

研究表明，低磷土壤(速效磷含量9.37～10.73 mg·kg-1)上隨著施磷量的增加，小麥胚乳 sss3、 sbe1基因相對(duì)表達(dá)量升高，中磷(速效磷含量19.54～20.71 mg·kg-1)、高磷土壤(速效磷含量37.46～38.77 mg·kg-1)施磷對(duì) sss3、 sbe1基因相對(duì)表達(dá)量調(diào)節(jié)不顯著[21]。本研究表明,施磷可顯著提高小麥胚乳 sbe1， sbe2a， sbe2b和 iso1基因的相對(duì)表達(dá)量，且CP處理下更加顯著，這說(shuō)明一定范圍內(nèi)施加磷肥有利于支鏈淀粉合成相關(guān)酶基因的表達(dá)。Wang等[22]認(rèn)為，SSS、SBE和DBE可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)淀粉的合成，與本研究結(jié)果基本一致。王樹(shù)亮等[23]研究表明，隨著土壤磷水平的提高，小麥各器官含磷量均有提高(其中籽粒磷含量提高幅度最小)，但磷素利用效率降低。姜宗慶[24]的研究表明，成熟期籽粒磷含量隨施磷量提高而增加，但施磷量超過(guò)一定水平則造成籽粒磷含量下降，與本研究的結(jié)果一致。由于AGPase與SBE酶活性均與磷素有關(guān)[8-9]，因此，不同磷處理下籽粒磷含量的不同可能暗示了這兩種酶活性的變化。

表2 不同磷水平下的小麥支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布Table 2 Chain-length distribution of wheat amylopectin under different phosphorus levels %

圖9 不同磷處理下的小麥籽粒全磷含量

支鏈淀粉的合成是多種酶協(xié)同作用的結(jié)果。姜宗慶等[10,24]研究發(fā)現(xiàn)，在缺磷土壤(速效磷含量4.1 mg·kg-1)上增加施磷量可提高小麥籽粒SS酶的活性、籽粒蔗糖含量和SBE酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，施磷提高了新冬20號(hào)胚乳SS酶活性和SBE酶活性峰值，且提前了新冬20號(hào)胚乳中DBE酶活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間。說(shuō)明磷處理促進(jìn)了淀粉合成原料蔗糖在籽粒中的積累，為淀粉合成提供了充足的原料，同時(shí)通過(guò)提高酶活高峰期的SBE酶活性和DBE酶活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間，提高了支鏈淀粉的合成速率，促進(jìn)了支鏈淀粉的積累。這與本研究結(jié)果中支鏈淀粉合成相關(guān)酶基因表達(dá)量、支鏈淀粉含量的提高相符。此外,本研究使用的試驗(yàn)材料新冬20號(hào)為南疆主栽弱冬性品種，早熟高產(chǎn)[25]，全生育期較短(約238 d)；而新冬23號(hào)則為北疆強(qiáng)冬性品種，中晚熟，中高產(chǎn)，全生育期較長(zhǎng)(280～290 d)[26]，品種特性差異可能是造成兩品種支鏈淀粉合成關(guān)鍵酶活性對(duì)磷素敏感性不同的原因。石河子大學(xué)冬小麥課題組的水培試驗(yàn)亦表明，新冬20號(hào)根系比新冬23號(hào)更加發(fā)達(dá)(未發(fā)表)，而根干重對(duì)植株磷素積累量有極顯著的直接作用[27]，此外，新冬20號(hào)生育期雖然較新冬23號(hào)短，但其產(chǎn)量卻比新冬23號(hào)高，說(shuō)明新冬20號(hào)對(duì)于磷素的吸收利用更加高效，因而其支鏈淀粉合成關(guān)鍵酶活性對(duì)磷素的敏感性相對(duì)較高。

本研究表明，適量施磷提高了支鏈淀粉中B鏈的比例，降低了A鏈的比例。這說(shuō)明磷處理下支鏈淀粉的外側(cè)鏈較短，對(duì)長(zhǎng)鏈的空間影響作用力較小，長(zhǎng)鏈的運(yùn)動(dòng)性較強(qiáng)，有利于相互靠攏形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。前人研究表明，支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布對(duì)淀粉的品質(zhì)特性有顯著的影響。DP 6～11支鏈與相對(duì)結(jié)晶度呈極顯著負(fù)相關(guān)，而DP 28～34支鏈與糊化溫度呈極顯著負(fù)相關(guān)[2]；除崩解值外，長(zhǎng)B鏈( DP≥65. 8)與黏度各特征值(峰值黏度、低谷黏度、最終黏度、反彈值、峰值時(shí)間)均呈極顯著正相關(guān)[28]。此外，Li等[11]的研究表明，施磷顯著提高了黏度特征值中的峰值黏度、低谷黏度、最終黏度和反彈值，顯著降低了糊化溫度，這與本研究中施磷提高B1鏈和B2鏈比例的結(jié)果相符。除長(zhǎng)、短鏈外，內(nèi)鏈、外鏈、平均鏈長(zhǎng)、分支化度以及內(nèi)外鏈比例對(duì)淀粉的結(jié)構(gòu)也有影響，磷對(duì)淀粉品質(zhì)特性的影響與這些因素的關(guān)系尚需深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，磷素處理下兩個(gè)小麥品種支鏈淀粉合成相關(guān)酶基因( sbe1、 sbe2a、 sbe2b、 iso1)的表達(dá)量顯著上調(diào)，相關(guān)酶的活性也有所提高，從而增加了籽粒支鏈淀粉含量和支鏈淀粉B鏈段比例。不同磷素處理下支鏈淀粉含量與分子精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化可能還與其他淀粉合成酶基因表達(dá)量的變化、酶活性的改變等有關(guān)，其具體原因尚需進(jìn)一步探究。

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