梁 嵐，韋會平，孫 妍，田金鳳

(攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)整合醫(yī)學(xué)教研室，四川 攀枝花 617000)

姜黃素是一種從姜科姜黃屬植物—姜黃的根莖提取物中分離得到的天然色素，純品姜黃素為黃色結(jié)晶狀的粉末，其分子量大小為368.38，用分子式C21H20O6來表示。姜黃素屬于多酚類化合物，其脂溶性好，易通過血腦屏障，性質(zhì)穩(wěn)定[1-2]。在我國姜黃素的臨床藥用歷史悠久，臨床上常用于治療鼻炎、鼻竇炎、呼吸道疾病等[2]。近年來對姜黃的活性成分研究顯示：姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用，姜黃素可顯著抑制大腦因缺血或再灌注引起的黃嘌呤氧化酶、過氧化陰離子、過氧化歧化酶、乳酸脫氫酶等的生成，且該過程與核因子E2轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)通路的激活密切相關(guān)，姜黃素的抗氧化應(yīng)激作用可降低腦組織所受的損傷及二次損傷起到保護(hù)腦組織的作用[3-6]，但是姜黃素在創(chuàng)傷性腦損傷中是否也有抗氧應(yīng)激的作用，目前尚不明確。創(chuàng)傷性腦損傷又稱腦外傷或腦損傷(traumatic brain injury，TBI)，是指由于機(jī)械性沖擊(穿透力、鈍擊力、加速力、減速力等)所致的顱腦外傷，包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷。繼發(fā)性腦損傷常引起體內(nèi)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等，促使繼發(fā)性生化降解發(fā)生，進(jìn)一步加重腦損傷程度[7]。腦外傷常引起患者的嚴(yán)重癱瘓或智力損傷，其致傷率、致殘率和致死率都很高[8]。鑒于姜黃素在缺血或再灌注腦損傷中的保護(hù)作用，本研究擬通過構(gòu)建大鼠腦創(chuàng)傷模型，研究姜黃素對腦損傷組織中Nrf2以及抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)、含量或活性的影響，以期望闡明姜黃素發(fā)揮腦損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制，為姜黃素用于創(chuàng)傷性腦損傷的臨床治療提供更多的理論支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠20只，體重260～280 g，4～8周齡，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供[SCXK(川)2013-024]，實驗在攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院實驗室完成[SYXK(川)2011-178]。本動物實驗的研究方案已獲得攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號：201504523，且所有實驗過程均符合動物倫理學(xué)和動物福利。

1.2 主要試劑及儀器

姜黃素液(美國，Sigma公司)按2 g/mL溶于二甲基亞砜(DMSO)后保存于4℃冰箱，使用時應(yīng)用生理鹽水稀釋2000倍成1 mg/mL[9]；Trizol試劑(美國，Invitrogen公司)；TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國，Life Technologies公司)；定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR)試劑盒(美國，GeneCopoeia公司)；免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢，博士德公司)；水合氯醛(天津，永大化學(xué)制劑公司)；兔抗鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗鼠β-catin抗體(美國，CST公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量檢測試劑盒(南京，建成生物工程研究所)；血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)ELISA檢測試劑盒、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inductive nitric oxide synthase，iNOS)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(上海，上海滬震生物科技)。

紫外可見分光光度計(美國，Thermo公司，Nanodrop 2000)；FS-1型電動勻漿器(江蘇，新瑞儀器)；自由落體式腦外傷造模裝置(上海，醫(yī)用儀器廠)；分析天平(上海，光學(xué)儀器廠)；Bio Rad IQ5實時熒光定量PCR儀(美國，Bio Rad)；Epoch超微量微孔板分光光度計(美國，BioTek)；高級研究型顯微鏡NIKON Eclipse 80i(日本，尼康)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將SPF級SD雄性大鼠20只隨機(jī)分成四組，分別為正常對照組，腦損傷模型組(TBI)，腦損傷溶劑組(TBI+S)，腦損傷姜黃素處理組(TBI+C)，每組各5只。

1.3.2 大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型的建立

在大鼠腦外傷動物模型制作前，將大鼠放入乙醚麻醉罐中麻醉，將大鼠俯臥捆綁并固定。其中大鼠頭部置于海綿墊上，在大鼠蘇醒有肢體活動時，使用500 g砝碼從造模裝置的55 cm立柱標(biāo)尺處自由墜落(砝碼方向豎直、對準(zhǔn)大鼠頭部正中)[10]。大鼠腦外傷模型造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠四肢活動不協(xié)調(diào)，行動遲緩，部分大鼠出現(xiàn)鼻/口腔出血，經(jīng)觀察和鑒定，該實驗中所用的腦損傷大鼠均造模成功，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實驗。

正常對照組僅給予麻醉和生理鹽水處理。TBI組、TBI+S組和TBI+C組均采用自由落體式腦外傷造模裝置進(jìn)行造模，造模成功后，TBI+C組腹腔注射姜黃素5 mg/kg(2 g/mL的母液用生理鹽水稀釋成1 mg/mL)，TBI+S組腹腔注射DMSO溶劑(DMSO原液用生理鹽水稀釋2000倍，即0.05%)，TBI組給予等量的生理鹽水處理。1 d后處死所有大鼠并取腦組織，迅速于-80℃凍存，以用于后續(xù)的RNA和蛋白提取。另外取大鼠大腦皮層腦組織標(biāo)本保存于4%多聚甲醛中，4℃冰箱保存以用于后續(xù)免疫組化檢測。

1.3.3 RNA提取和純度/濃度檢測

操作中使用的所有器皿、試劑和材料均經(jīng)160℃高溫消毒。取液氮中保存的組織樣品，于分析天平上各稱取100 mg，置于2 mL的EP管中，每份樣本中分別加入700 μL的TRIzol試劑，研磨充分后室溫放置5 min，加入140 μL的氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min 后12 000 r/min，4℃離心15 min。將上層液體吸出并轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入Trizol試劑2倍體積的異丙醇，混勻后靜置10 min，離心去上清。1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，轉(zhuǎn)速7500 r/min，4℃離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μL無酶雙蒸水溶解，取1 μL測RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將分裝出的1 μL總RNA用于濃度測定，紫外可見分光光度計用于檢測A260/A280值，其中取1 μL無酶水用作空白校對，當(dāng)A260/A280<3時，可進(jìn)行RNA濃度檢測。樣本RNA濃度檢測前可簡單離心，分別記錄所測的RNA濃度值和A260/280值。當(dāng)A260/A280=1.8～2.0時，RNA濃度適中，可用于后續(xù)qRT-PCR實驗。

1.3.4 qRT-PCR檢測

以1.3.3中提取的組織RNA為模板，按TaqMan的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板，按GeneCopoeia公司的qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測設(shè)備為Bio Rad IQ5實時熒光定量PCR儀。所有引物均由美國Invitrogen公司合成。Nrf2上游引物：5′-TTCCTCT GCTGCCATTAGTCAGT-3′，下游引物：5′-GCTCTTC CATTTCCGAGTCACT-3′，擴(kuò)增片段長度為215 bp，以β-actin為檢測內(nèi)參，2-ΔΔCT用于計算相對表達(dá)量。反應(yīng)體系為20 μL，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.5 組織蛋白的提取

將切除的大鼠腦組織塊迅速置于預(yù)冷生理鹽水中漂洗，將組織切成小塊(200 mg～1 g之間)，分析天平上稱重，加入組織質(zhì)量數(shù)值10倍的哺乳動物組織總蛋白提取試劑(提前按比例加入酶抑制劑)，在組織勻漿器中均漿，將組織研磨完全。隨后進(jìn)行超聲處理，冰上裂解4～5 h，10 000 r/min離心10 min，取中層溶液，加入等體積的蛋白上樣緩沖液(稀釋2倍)，隨后置于100℃水浴箱沸水浴中變性5 min，分裝到-80℃中保存。

1.3.6 Western Blot檢測

按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書進(jìn)行操作，鑒定蛋白濃度。每組分別取30 μg樣本，進(jìn)行10%的SDS-PAGE凝膠電泳實驗。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1～2 h，加入1∶2000的兔抗鼠Nrf2多克隆抗體和1∶1000兔抗鼠β-catin抗體，4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶10 000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光劑并用X片曝光、顯影、定影、掃描并保存條帶圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白的條帶的灰度值和內(nèi)參β-actin的蛋白灰度值比值來確定目的蛋白的相對表達(dá)水平，每組實驗設(shè)置三個復(fù)孔。

1.3.7 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測

分析天平上分別稱取各組大鼠腦組織100 mg，放入干凈的勻漿管中，加入預(yù)冷的生理鹽水(0.9%，腦組織體積的10倍)，迅速用眼科剪將組織剪碎，勻漿器上勻漿(冰上)，2000 r/min離心5～10 min，收集上清液，-20℃中保存?zhèn)溆?。分別按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過化學(xué)比色法檢測大鼠腦組織中MDA和GSH的含量、SOD和CAT的活力。

1.3.8 腦組織中HO-1和iNOS活力檢測

分析天平上稱取大鼠腦組織100 mg，加入10倍體積預(yù)冷0.9%生理鹽水，迅速用眼科剪將組織剪碎，勻漿器上勻漿(冰上)，2000 r/min離心10 min，收集上清液。按照HO-1和iNOS的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔(無酶標(biāo)試劑)、樣品孔。分別為標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入酶標(biāo)包被板，40 μL樣品稀釋液加入待測樣品孔，待測樣品10 μL，封板后37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育5 min。將濃縮洗滌液稀釋30倍以備用，揭去封板膜，棄液體甩干，加洗滌液靜置30 s，棄洗滌液，重復(fù)5次，甩干，加酶標(biāo)試劑，每孔500 μL，空白孔，不加，37℃孵育3 min，洗滌液洗滌，加入顯色劑(A液50 μL，B液50 μL，將A液和B液混勻)。37℃錫箔紙避光后顯色15 min。顯色結(jié)束后向每孔加入50 μL的反應(yīng)終止液。超微量微孔板分光光度計用以檢測吸光度(OD值，波長450 nm)，并設(shè)置空白調(diào)零孔。實驗數(shù)據(jù)處理：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)物濃度，縱坐標(biāo)-OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測的樣品OD值所對應(yīng)的濃度，實際濃度為對應(yīng)濃度值乘以稀釋倍數(shù)，根據(jù)說明書提供的公式計算大鼠腦組織勻漿液中HO-1、iNOS的活力。

1.3.9 免疫組化檢測Nrf2的表達(dá)

PBS沖洗，共3次，每次5 min，加顯色劑(配置方法：1 mL水中1滴顯色劑A，1滴顯色劑B，1滴顯色劑C)混勻，清水沖洗10 min后，蘇木精復(fù)染，水中沖洗干凈切片，依次放入70%無水乙醇，80%無水乙醇，95%無水乙醇，100%無水乙醇-二甲苯，二甲苯。各2 min，將切片置于通風(fēng)櫥中，中性樹膠封片晾干，顯微鏡下采集圖像(×200)，Nrf2蛋白表達(dá)的定性研究采用直接觀察是否核表達(dá)，根據(jù)陽性細(xì)胞在全部組織細(xì)胞中所占比例和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度判定實驗結(jié)果∶A∶按顯色細(xì)胞數(shù)記分，陽性細(xì)胞數(shù)<1/3為1分，陽性細(xì)胞數(shù)1/3～2/3為2分，陽性細(xì)胞數(shù)>2/3為3分。 B∶按細(xì)胞顯色深淺記分，無陽性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分?jǐn)?shù)=A×B。A×B=0判斷為(-)，A×B=1～2判斷為(+)，A×B=3～4為(++)，A×B=5～9為(+++)，該半定量評分由我院三位病理科技術(shù)人員共同閱片打分，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Nrf2在腦組織中的mRNA和蛋白表達(dá)

四組腦組織中Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)水平整體比較,差異均有顯著性(P<0.05)。與正常對照組比較，TBI 組、TBI+S 組腦組織中Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與TBI組及TBI+S組比較，TBI+C組腦組織中Nrf2mRNA和蛋白表達(dá)水平則明顯降低(P<0.05)，而TBI組與TBI+S組比較差異無顯著性(P>0.05)。Nrf2 蛋白表達(dá)水平見圖1A，Nrf2 mRNA表達(dá)水平見圖1B，數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 Nrf2在腦組織中的mRNA和蛋白表達(dá)(n=5)Tab.1 Expressions of Nrf2 mRNA and protein in the brain tissues

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group,#P<0.05.

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。圖1 QRT-PCR和West Blot檢測Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)水平 Note.Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group, #P<0.05.Fig.1 Expresssion levels of Nrf2 mRNA and protein detected by qRT-PCR and West blot

2.2 腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT含量/活性變化

四組腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT含量/活性整體比較，差異均有顯著性(P<0.05)。與正常對照組比較，TBI組和TBI+S組腦組織中SOD、CAT活性，GSH的含量顯著降低，而MDA的含量顯著增加(P<0.05)。與TBI組、TBI+S組比較，TBI+C組的腦組織中SOD、CAT活性，GSH的含量顯著增加(P<0.05)，而MDA的含量顯著降低(P<0.05)，而TBI組與TBI+S組比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖2和表2。即姜黃素治療可使腦損傷組織中SOD和CAT活性，GSH含量增加，MDA含量降低，逆轉(zhuǎn)腦損傷所致的抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子的改變趨勢。

2.3 腦組織中HO-1和iNOS含量變化

四組腦組織中HO-1和iNOS含量整體比較，差異均有顯著性(P<0.05)。與正常對照組相比，TBI組和TBI+S組腦組織中HO-1和iNOS的含量均顯著增加(P<0.05)。與TBI組、TBI+S組比較，TBI+C組腦組織的HO-1和iNOS含量顯著降低(P<0.05)，而TBI組與TBI+S組比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖3和表3。即姜黃素可逆轉(zhuǎn)腦外傷所致的HO-1和iNOS的含量增加。

表2 腦外傷對大鼠腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT含量/活性的影響(n=5)Tab.2 Effects of traumatic brain injury on the content/activity of MDA, GSH，SOD and CAT in the rat brain tissues

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group，#P<0.05.

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。圖2 腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT含量/活性比較Note.Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group, #P<0.05.Fig.2 Comparison of the contents of MDA, SOD and CAT in the brain tissues

組別GroupsHO-1(Pg/mg)iNOS(ng/mg)正常對照組Controlgroup186.20±0.7266.68±3.46TBI組TBIgroup293.42±3.19*199.37±3.48*TBI+S組TBI+Sgroup287.22±5.02*202.83±4.78*TBI+C組TBI+Cgroup191.17±3.27#95.28±3.18#F1483.0111734.844P0.0000.000

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group，#P<0.05.

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。圖3 腦組織中HO-1和iNOS含量變化Note.Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group，#P<0.05.Fig.3 Changes of HO-1 and iNOS contents in the brain tissues

2.4 免疫組化檢測Nrf2表達(dá)

四組腦組織中Nrf2的蛋白表達(dá)整體比較，差異有顯著性(P<0.05)。與正常對照組相比，TBI組和TBI+S組腦組織中Nrf2的蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與TBI組、TBI+S組相比，TBI+C組的Nrf2的蛋白表達(dá)則明顯降低(P<0.05)，而TBI組與TBI+S組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表4及圖4。

客戶服務(wù)代表、銷售代表、供應(yīng)鏈專業(yè)人員、市場專員，他們從“數(shù)據(jù)分析”中獲得的信息都是不一樣的，據(jù)此安排的活動和獲得的結(jié)果也是因人而異。當(dāng)為商業(yè)問題提供一個“數(shù)據(jù)分析”解決方案時，需要將客戶作為考慮的和規(guī)劃優(yōu)化用戶重點。

表4 免疫組化檢測腦組織中的Nrf2表達(dá)(n=5)Tab.4 Immunohistochemical detection of Nrf2 expression in the brain tissues

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group，#P<0.05.

3 討論

注：腦組織切片：A：正常對照組，B：TBI組，C：TBI+S組，D：TBI+C組4組大鼠的切片。淺黃色、棕黃色或棕褐色部位為Nrf2核表達(dá)的陽性細(xì)胞，藍(lán)色部位為細(xì)胞核染色。與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。圖4 免疫組織化學(xué)檢測Nrf2蛋白的表達(dá)水平(×400)Note.Brain tissues from a rat of the control group (A), TBI group (B), TBI+S group (C) and TBI+C group (D). Pale yellow, pale brown and brown colors indicate the positive cells with nuclear expression of Nrf2. Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group, #P<0.05.Fig.4 Immunohistochemical detection of expression levels of Nrf2 protein in the brain tissues

姜黃素是從姜黃和莪術(shù)等植物根莖中分離純化后得到的一種黃色粉末，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，脂溶性強(qiáng)，體內(nèi)代謝迅速，藥理作用廣泛，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用，臨床常用于治療鼻炎，鼻竇炎，呼吸道疾病等[3-6]。由于姜黃素口服時存在首關(guān)效應(yīng)及代謝迅速的現(xiàn)象，其生物利用度較低，因此臨床上姜黃素多用于治療腸道疾病[11]。近年來，有大量研究報道顯示姜黃素對改善急性腎損傷、缺氧或缺血性腦損傷、腦損傷后的炎癥反應(yīng)、大腦因缺血或再灌注引起的腦損傷等有很好的療效，但姜黃素發(fā)揮腦損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制仍不明確[12-13]。

腦外傷是機(jī)械性外力所致的顱腦創(chuàng)傷，可對患者的生理和心理造成嚴(yán)重?fù)p傷，其致死和致殘率極高[14]。研究顯示氧化應(yīng)激在腦外傷康復(fù)中發(fā)揮著重要的作用，腦外傷導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧，期間活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量產(chǎn)生，ROS產(chǎn)生量大于機(jī)體可承受的抗氧化能力后，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，保護(hù)損壞組織[15-16]。人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)易發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使神經(jīng)元受損傷，此時中樞神經(jīng)系統(tǒng)可調(diào)用內(nèi)源性抗氧化酶防御體系，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，保護(hù)神經(jīng)元免受損傷[17-18]。人體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)分兩種。一種為抗氧化酶類，如SOD、CAT等。一種為非酶性抗氧化劑，如還原性GSH、MDA等[19-20]。本研究中我們檢測了腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT的含量/活力變化，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，TBI組和TBI+S組腦組織中SOD和CAT活性，GSH的含量顯著降低，而MDA的含量顯著增加(P<0.05)，而姜黃素可逆轉(zhuǎn)該變化。即姜黃素可使腦損傷后機(jī)體抗氧損傷的酶SOD和CAT的活性增加，而脂質(zhì)氧化損傷后的產(chǎn)物MDA的含量減少，GSH的含量增加，該研究結(jié)果與已有研究一致[21]。

Nrf2為含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，機(jī)體未受損傷時，常存在于細(xì)胞漿中。研究顯示細(xì)胞質(zhì)接頭蛋白(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)可與Nrf2的氨基端特異性結(jié)合，抑制Nrf2活性，機(jī)體受刺激時，Nrf2經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，磷酸化的Nrf2可通過ERK、P38等通路與Maf家族蛋白結(jié)合形成二聚物，隨后Nrf2與ARE相結(jié)合，激活下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶的表達(dá)，誘導(dǎo)多種抗氧化酶及解毒酶基因的協(xié)同表達(dá)，例如iNOS和HO-1，從而發(fā)揮對組織/細(xì)胞的保護(hù)作用[22-23]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，TBI組、TBI+S組腦組織中Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，iNOS和HO-1的含量也顯著增加(P<0.05)；與TBI組、TBI+S組相比，姜黃素治療后腦損傷腦組織中Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，iNOS和HO-1的含量也顯著減少(P<0.05)，即姜黃素可逆轉(zhuǎn)Nrf2、iNOS和iNOS的變化。表明姜黃素能夠下調(diào)Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)，通過抑制Nrf2的表達(dá)，激活和誘導(dǎo)下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶iNOS和HO-1的表達(dá)，發(fā)揮腦損傷的保護(hù)作用，實驗結(jié)果與已有研究相一致[24]。

此外，本研究采用采用DMSO作為姜黃素的溶劑。為排除DMSO所產(chǎn)生的影響，特增加溶劑對照組(即文中TBI+S組)。試驗結(jié)果表明，該組的mRNA和蛋白表達(dá)水平和TBI組相近(P>0.05)，其它指標(biāo)如腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT、HO-1和iNOS含量/活性變化或免疫組化所測得Nrf2表達(dá)水平，都和TBI組差別不大。即提示其可能的腦保護(hù)功能并未出現(xiàn)。究其原因，是因為一則DMSO的腦保護(hù)功能可能相對有限，且和陽性組(即TBI+C組)同樣加入，即使存在有限的腦保護(hù)作用，其誤導(dǎo)干擾影響也是均衡的；二則本實驗中最終姜黃素的溶解溶劑并不是純DMSO，其中DMSO的量非常較少，幾乎可以忽略不計。具體為：姜黃素先配置成2 g/mL的母液(溶劑為DMSO)，實驗時用生理鹽水稀釋2000倍成1 mg/mL，其中DMSO的量非常少，體積百分濃度約為1/2000，起不到明顯的腦保護(hù)作用。但在今后的研究中，還將進(jìn)一步關(guān)注此問題。

綜上，姜黃素可促進(jìn)腦損傷大鼠腦組織的抗氧化應(yīng)激作用，它能夠通過降低Nrf2的表達(dá)，激活下游抗氧應(yīng)激相關(guān)的通路，使下游抗氧應(yīng)激相關(guān)的指標(biāo)發(fā)生改變，從而起到對腦組織的保護(hù)作用。

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