李欣悅，佟 巍，張麗芳，阮研碩，叢日旭，向志光

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

核酸檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用，它可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染早期檢測(cè)到病原微生物核酸，還可以持續(xù)監(jiān)測(cè)感染動(dòng)物的排毒狀態(tài)[1]。小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)和呼腸孤病毒III型(reovirus 3，Reo-3)是最主要的且是最常見的嚙齒類動(dòng)物感染病原體[2]，小鼠諾如病毒(murine norovirus，MNV)是實(shí)驗(yàn)小鼠感染率較高的病原體[3]。這三種病毒常呈隱性感染，一定條件下才會(huì)發(fā)病，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康和實(shí)驗(yàn)研究。因此對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便或盲腸內(nèi)容物進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)是非常重要的。目前已建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒核酸檢測(cè)方法，在實(shí)際應(yīng)用中采樣處理和樣品檢測(cè)步驟中間，需經(jīng)過一段時(shí)間的運(yùn)輸和儲(chǔ)存。但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便或盲腸內(nèi)容物復(fù)雜，樣品的運(yùn)輸或保存不當(dāng)可能會(huì)影響核酸提取質(zhì)量，進(jìn)而影響核酸檢測(cè)結(jié)果，特別是RNA病毒。針對(duì)病毒特性和不同類型的樣品的特點(diǎn)，應(yīng)確定相應(yīng)運(yùn)輸溫度和核酸穩(wěn)定劑的使用。RNA提取試劑的裂解液可抑制生物樣品中的RNA酶，可以作為備選儲(chǔ)存劑。而在樣品運(yùn)輸時(shí)較為方便的條件為藍(lán)冰運(yùn)輸，該運(yùn)輸溫度可維持在0℃～8℃。本研究比較了MHV，Reo-3，MNV三種病毒參考品在裂解液和生理鹽水中，在不同儲(chǔ)存溫度及時(shí)間等運(yùn)輸條件下病毒檢出量的變化。

表1 引物和探針序列Tab.1 Primers and probe sequences

1 材料和方法

1.1 參考品的制備

MHV、Reo-3、MNV等病毒來源于the American Type Culture Collection (ATCC)，本室保存。小鼠盲腸內(nèi)容物采自-送檢至我實(shí)驗(yàn)室的SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[SYXK(京)2014-002]進(jìn)行，并獲得本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(IACUC：XZG17001)。對(duì)盲腸內(nèi)容物應(yīng)用核酸檢測(cè)方法排除了MHV、Reo-3、MNV及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)須排除的病原項(xiàng)目。將SPF級(jí)小鼠的盲腸內(nèi)容物混合分為三組，按每0.1 g加入50 μL 50倍稀釋的病毒原液，制成三種病毒的參考品，使參考品初始病毒核酸量在104～107copies/μL范圍之間。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品分組及保存

將參考品按1∶4的比例加入 Buffer AVL，顛倒混勻10次，室溫放置2 min后，按每管200 μL分裝制成Buffer AVL 組樣品，分別置于4℃冰箱(2℃～8℃)和室溫(22℃～25℃)保存1、2、3、7、14 d。生理鹽水(normal saline, NS)組樣品以同樣的方式處理。分別于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取兩個(gè)平行樣品置-80℃保存。

1.2.2 樣品RNA提取

各時(shí)間點(diǎn)樣品經(jīng)12 000 r/min離心5 min后，取140 μL上清液，用QIAGEN公司病毒RNA提取試劑盒進(jìn)行樣品RNA提取。

1.2.3 探針法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè)

試劑采用Takara公司的One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，引物和探針序列[4-5]見表1。用ABI 7500 Fast 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)對(duì)各樣品進(jìn)行熒光PCR分析。以1×101～1×107copies/μL的稀釋質(zhì)粒樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品的病毒檢出量。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

所有實(shí)驗(yàn)步驟均在生物安全二級(jí)(BSL-2)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，其中病毒參考品的制備，樣品分組以及樣品RNA提取當(dāng)中的裂解步驟均在A2型生物安全柜內(nèi)操作。

2 結(jié)果

2.1 參考品初始病毒核酸量及其在real time PCR中的 CT值

本研究以參考品0 d時(shí)檢測(cè)的病毒檢出量為基值，計(jì)算并比較各時(shí)間點(diǎn)樣品病毒檢出量的變化。其中MHV 參考品0 d時(shí)CT值為19.31，病毒核酸量為2×106copies/μL。Reo-3參考品0 d時(shí)CT值為25.05，病毒核酸量為5×104copies/μL。MNV參考品0 d時(shí)CT值為16.30，病毒核酸量為2.5×105copies/μL。

2.2 保存劑對(duì)核酸樣品檢出量的影響

無論是4℃還是室溫保存，生理鹽水組的參考品2 d病毒檢出量都在50%以下，遠(yuǎn)低于buffer AVL組。其中MHV生理鹽水組1 d時(shí)已降低至15%；Reo-3生理鹽水組1 d病毒檢出量為73%，而2 d時(shí)已降低至7%，其下降幅度最為顯著，如圖1～6所示。因此，buffer AVL可以作為樣品保存劑，具有延緩RNA降解的作用。

2.3 存儲(chǔ)溫度對(duì)樣品檢出量的影響

4℃ buffer AVL組MHV參考品在1、2、3、7 d病毒檢出量分別降低了0%、16%、42%、76%，而室溫組樣品在1、2 d病毒檢出量分別降低了14%、69%，如圖1和圖2所示；4℃ buffer AVL組Reo-3參考品1、2、3、7 d病毒量分別降低了3%、11%、17%、50%，而室溫組樣品在1、2 d病毒檢出量分別降低了3%、40%，如圖3和圖4所示；4℃ buffer AVL組MNV參考品1、2、3、7 d病毒量分別降低了11%、16%、35%、60%，而室溫組樣品在1、2 d病毒檢出量分別降低了49%、56%，如圖5和圖6所示。Buffer AVL組樣品室溫組樣品的病毒檢出量的下降幅度明顯高于4℃組。

2.4 保藏時(shí)間對(duì)樣品核酸檢出量的影響

4℃ Buffer AVL組MHV、Reo-3、MNV三種病毒參考品在3 d時(shí)間點(diǎn)的病毒檢出量在50%以上，分別為58%、83%、65%；在7 d時(shí)間點(diǎn)仍有檢出，但已經(jīng)降低至24%、50%、40%；在14 d時(shí)間點(diǎn)無檢出，如圖1、圖3和圖5所示。

圖1 4℃保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)小鼠肝炎病毒核酸檢出量變化Fig.1 Changes of the amount of MHV nucleic acid in cecal content samples stored at 4℃for different days

圖2 室溫保存盲腸內(nèi)容物樣品2 d內(nèi)小鼠肝炎病毒核酸檢出量變化Fig.2 Changes of the amount of MHV nucleic acid detected in cecal content samples stored at room temperature for 2 days

圖3 4℃保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)的呼腸孤病毒III型核酸檢出量變化Fig.3 Changes of the amount of Reo-3 nucleic acid detected in the cecal content samples stored at 4℃ for different days

圖4 室溫保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)的呼腸孤病毒III型核酸檢出量變化Fig.4 Changes of the amount of Reo-3 nucleic acid detected in the cecal content samples stored at room temperature for 2 days

圖5 4℃保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)的小鼠諾如病毒核酸檢出量變化Fig.5 Changes of the amount of MNV nucleic acid detected in cecal content samples stored at 4℃ for different days

圖6 室溫保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)的小鼠諾如病毒核酸檢出量變化Fig.6 Changes of the amount of MNV nucleic acid detected in the cecal content samples stored at room temperature for 2 days

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便樣品應(yīng)使用具有抑制RNA酶活性的保存劑進(jìn)行運(yùn)輸

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣品從現(xiàn)場(chǎng)采集到樣品檢測(cè)之間存在一段運(yùn)送過程。動(dòng)物糞便樣品以及盲腸內(nèi)容物等樣品成分復(fù)雜，含有大量的酶類，其中包括RNA酶。而這些樣品中的病毒等檢測(cè)的靶標(biāo)為病毒的核酸，極易受到樣品中RNA酶的影響而降解。因此需要盡早抑制樣品中RNA酶的活性。本研究結(jié)果表明，選擇使用RNA提取試劑中的裂解液為保存液，與生理鹽水組相比，可以提高核酸檢出率。究其原因，在于RNA提取試劑裂解液中的RNA酶抑制劑有效的抑制了內(nèi)源性的RNA酶，對(duì)核酸樣品進(jìn)行了有效保護(hù)。

3.2 關(guān)于低溫運(yùn)輸

4℃ Buffer AVL保存條件的三種病毒參考品的核酸量降低幅度小于室溫條件，說明低溫運(yùn)輸與有利于樣品核酸的檢測(cè)。使用干冰運(yùn)輸，儲(chǔ)存溫度接近-70℃，某種意義上對(duì)核酸樣本的保護(hù)更有利。但干冰運(yùn)輸?shù)某杀据^高。在本研究中使用藍(lán)冰運(yùn)輸并結(jié)合使用RNA提取試劑中的裂解液作為保護(hù)劑，在3 d時(shí)間點(diǎn)的病毒檢出量減少量在50%以內(nèi)，我們認(rèn)為MHV、Reo-3、MNV三種病毒盲腸內(nèi)容物樣品的核酸檢測(cè)在3 d內(nèi)完成，其檢測(cè)結(jié)果較為可靠。因此，以RNA提取試劑中的裂解液為保護(hù)劑和藍(lán)冰運(yùn)輸(0℃～8℃)即可基本滿足此類核酸檢測(cè)樣品短途儲(chǔ)運(yùn)的需求，且可降低運(yùn)輸成本。

3.3 核酸定量檢測(cè)方法的適用性

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物核酸檢測(cè)方法包括普通PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，其檢測(cè)的目標(biāo)為微生物的核酸分子。檢測(cè)結(jié)果以檢出或未檢出進(jìn)行描述，出具定性結(jié)果報(bào)告。本研究為了分析檢出量的變化采用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法。針對(duì)三種消化道病原體建立的real-time PCR檢測(cè)體系，其對(duì)低拷貝樣品的檢測(cè)下限達(dá)到10 copies/μL，(MHV 1×101copies/μL樣品CT值35.61；Reo-3 1×101copies/μL樣品CT值36.96；MNV 1×101copies/μL樣品CT值31.05，結(jié)果未顯示)，此類方法滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便樣品的檢測(cè)需求。

為了更好的測(cè)試保存和運(yùn)輸條件對(duì)于核酸樣品的影響，本研究所使用的模擬樣品的起始濃度為5×104～2×106copies/μL，檢測(cè)的CT值為16.30至25.05，此樣品濃度在real-time PCR檢測(cè)方法的最佳檢測(cè)范圍內(nèi)[6],在核酸樣品濃度有限降低時(shí)(本研究中下降98%)仍可有效檢測(cè)。通過MHV、MNV感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得的陽(yáng)性盲腸內(nèi)容物和糞便樣品，經(jīng)real-time PCR檢測(cè)樣品CT值在20～28范圍內(nèi)[1, 7-8]，而本研究的模擬樣品與實(shí)際樣品相比其病原核酸濃度偏高，其目的在于展示儲(chǔ)運(yùn)條件對(duì)于核酸樣品檢測(cè)的影響。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶其他病原體的樣品對(duì)儲(chǔ)運(yùn)條件的敏感性亦可進(jìn)行類似的測(cè)試。同時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原核酸的檢測(cè)也應(yīng)該考慮核酸擴(kuò)增反應(yīng)存在的其他干擾因素。

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